Semnalul extracelular - izoformul kinazei reglementate ERK1 este necesar în mod special pentru in vitro și in
Abstract
Până în prezent, nicio dovadă in vitro nu a arătat un rol diferențial pentru cele două izoforme principale ale căii ERK (ERK1 și -2) și sunt activate de aceiași stimuli. Cu toate acestea, dizabilitatea in vivo ERK1 sau -2 duce la fenotipuri diferite, demonstrând roluri diferite pentru cele două izoforme. Embrionii de șoareci lipsiți de ERK2 mor în uter înainte de ziua 8.5 din cauza unui defect al dezvoltării trofoblastului și mezodermului (10,11). Dimpotrivă, șoarecii ERK1 -/- sunt viabile și fertili; au maturizarea deficitară a timocitelor (12) și o memorie îmbunătățită pe termen lung (13).
Folosind animalele ERK1 -/- (12), am studiat implicarea acestei izoforme în adipogeneza in vivo și in vitro. Perturbarea genei ERK1 modifică dezvoltarea țesutului adipos la șoareci pe o dietă normală și duce la rezistență la obezitate indusă de grăsimi bogate în grăsimi. Arătăm că fibroblastele și preadipocitele embrionului de șoarece izolate din țesutul adipos adult al șoarecilor ERK1 -/- au afectat adipogeneza. Prezentăm dovezi că acest defect poate fi atribuit lipsei specifice a ERK1, deoarece adipogeneza reziduală a celulelor ERK1 -/- nu este afectată de U0126, un inhibitor foarte puternic și specific al MEK. Prin urmare, analiza ERK1 -/- animalelor și celulelor leagă în mod clar diferențierea adipocitelor afectate de adipozitatea redusă și rezistența la obezitate indusă de grăsimi.
PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII
Am generat șoareci ERK1 -/- de la heterozigoti emiși de la șase încrucișări cu animale C57BL/6, așa cum s-a descris anterior (12), iar controlul a venit de la același încrucișat. Șoarecii erau găzduiți pe un program de 12 ore de lumină/întuneric și aveau acces gratuit la apă și alimente. Sarcina bogată în grăsimi (45% grăsimi, 35% carbohidrați și 20% proteine) și dieta standard (10% grăsimi, 70% carbohidrați și 20% proteine) au fost achiziționate de la SAFE (Epinay/Orge, Franța). Experimentele au fost efectuate urmând linii directoare etice standard (liniile directoare ale Uniunii Europene privind îngrijirea în laborator a animalelor) și au fost aprobate de către Facultatea de Medicină a Universității din Nice-Sophia Antipolis.
Diferențierea celulelor și a adipocitelor.
Fibroblastele embrionare de șoarece au fost preparate în ziua 14 postcoitum așa cum s-a descris anterior (14). Preadipocitele din țesutul adult au fost izolate din tampoanele de grăsime subcutanate ale șoarecilor în vârstă de 8 săptămâni (15). Apoi, 2 zile de celule postconfluente au fost tratate timp de 48 de ore cu un cocktail de diferențiere a adipocitelor conținând 5 μg/ml insulină, 0,25 μmol/l dexametazonă, 0,5 mmol/l IBMX (3-izobutil-1-metilxantină) și 10 μmol/l tiazolidindionă. Mediul a fost apoi înlocuit timp de 6 zile de mediul Eagle modificat de Dulbecco numai cu insulină și tiazolidindionă. Acumularea de trigliceride a fost măsurată folosind un kit (Triglyceride 100; ABX Diagnostics, Montpellier, Franța). Activitatea glicerol-6-fosfat dehidrogenazei a fost măsurată conform descrierii (16).
PCR cantitativă în timp real.
Analiza expresiei genice a fost efectuată cu un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) și cu reactivi SYBR Green (Eurogentec, Seraing, Belgia). ADNc-urile au fost sintetizate din 2 μg de ARN total folosind transcriptaza inversă Superscript II (Invitrogen). Setul de grunduri a fost proiectat în conformitate cu software-ul producătorului. Probele conțineau 1 × SYBR Green Master Mix, 0,5 μmol/l primer și 1/50 ADNc sintetizat într-un volum de 25 μl. Condițiile PCR au fost după cum urmează: 10 min la 95 ° C, apoi 40 de cicluri de 15 s la 94 ° C, 30 s la 60 ° C și 1 min la 72 ° C. Am folosit 36B4 ca control intern.
Studii metabolice.
Testele de toleranță la glucoză și insulină au fost efectuate pe animale în vârstă de 13 până la 14 săptămâni la 7 săptămâni după începerea dietei. Glucoza (2 g/kg) și insulina (0,75 UI/kg) au fost administrate prin injecție intraperitoneală la șoareci treji. Probele de sânge au fost extrase din vena cozii la momentul indicat și glicemia a fost determinată folosind un test biochimic (Glucose PAP 250; ABX Diagnostics) și benzile active Accu-Check (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Cuantificarea trigliceridelor și a acizilor grași liberi a fost efectuată folosind, respectiv, trigliceridele 100 (ABX Diagnostics) și NEFA-C (Wako Chemicals, Neuss, Germania) kituri biochimice.
Cheltuieli de energie, coeficient respirator și activitate locomotorie.
Șoarecii au fost plasați timp de 22 de ore într-o cușcă metabolică conectată la un sistem de calorimetrie indirectă cu circuit deschis, cu debitul de aer ajustat la 0,5 l/min. Temperatura din cușca metabolică (24 ± 1 ° C) a fost stabilă și controlată pe tot parcursul experimentului. Consumul de oxigen și producția de dioxid de carbon au fost înregistrate la intervale de 10 s, utilizând un program de achiziție de date asistat de computer. Procesarea asistată de computer a schimburilor respiratorii și a semnalelor de activitate spontană a făcut posibilă calcularea acelei părți din rata metabolică totală dedicată alimentării costului energetic al activității și astfel (prin extragerea continuă a energiei cheltuite cu activitatea) pentru a calcula metabolismul de repaus al acestor șoareci în mișcare liberă (17). Șoarecii au fost adăpostiți în cușca metabolică la 1000 de ore fără hrană, dar cu apă. Cheltuielile de energie de repaus postabsorbtive (echivalent cu metabolismul bazal) au fost măsurate între 1600 și 1800 de ore. La 1800 h, 1 g din dieta obișnuită bogată în grăsimi a fost administrată șoarecilor, iar răspunsul termogen la hrănire (metabolism și coeficient respirator [RQ]) a fost calculat timp de 8 h ca creștere a metabolismului și RQ peste nivelurile inițiale premeal.
Măsurarea activării ERK.
Extractele de țesut au fost preparate utilizând tampon de liză (9) și au fost analizate prin Western blot folosind anticorpi împotriva ERK fosforilat pe Thr202/Tyr204 (Cell Signaling Technology) și ERK total (Santa Cruz).
REZULTATE
Șoarecii ERK1 -/- au adipozitate redusă în comparație cu animalele de tip sălbatic.
Dieta bogată în grăsimi stimulează activitatea ERK în țesutul adipos alb.
Pentru a investiga rolul căii ERK în dezvoltarea obezității, șoarecii au fost supuși unei diete bogate în grăsimi (45% din totalul caloriilor provin din grăsimi). Am întrebat dacă dieta bogată în grăsimi a indus activarea căii ERK în țesutul adipos alb, ficat și mușchi. Așa cum se arată în FIG. 2 (și datele nu sunt prezentate), dieta bogată în grăsimi nu a avut niciun efect asupra expresiei ERK1 și -2 în cele trei țesuturi. Mai mult, activitatea ERK nu este modificată în ficat (Fig. 2A) și mușchi (date neprezentate) în regimul hipercaloric. În schimb, activitatea totală a ERK a fost de peste trei ori mai mare în țesutul adipos alb de la șoareci cu o dietă bogată în grăsimi, comparativ cu animalele din dieta standard (Fig. 2B). Interesant este faptul că adipocitele de la pacienții obezi cu diabet zaharat de tip 2 au activitate ERK mai mare decât pacienții martori (18), sugerând o corelație importantă între activitatea ERK crescută și obezitate.
Șoarecii cu deficit de ERK1 sunt rezistenți la obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi și mai sensibili la insulină.
Pentru a determina dacă dizabilitatea ERK1 previne apariția obezității, am analizat incidența dietei bogate în grăsimi la șoarecii de tip sălbatic și knockout. Așa cum era de așteptat, șoarecii de control au devenit în mod semnificativ obezi în urma unei diete bogate în grăsimi, în comparație cu colegii lor cu o dietă standard (10% din caloriile totale din grăsimi). În schimb, șoarecii ERK1 -/- nu au dezvoltat obezitate (Fig. 3A). Într-adevăr, la o dietă bogată în grăsimi, creșterea medie în greutate pe săptămână a fost semnificativ mai mare la șoarecii martor decât la șoarecii ERK1 -/- (2,9 ± 0,4 vs. 1,7 ± 0,3 g/săptămână, respectiv; P -/- animale sub dieta grasă, tampoanele de grăsime inghinale și grosimea subcutanată a grăsimii au fost reduse cu 51 și, respectiv, 30% (Fig. 3B). alternativ, deoarece dizabilitatea ERK1 nu a blocat complet dezvoltarea țesuturilor adipoase, nu putem exclude faptul că tampoanele de grăsime epididimă, dar niciun alt depozit nu a atins dezvoltarea maximă atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci ERK1 -/- nu s-a observat nicio diferență de aport alimentar între șoarecii ERK1 -/- și ERK1 +/+ pe o dietă bogată în grăsimi (datele nu sunt prezentate).