Inozina reduce inflamația și îmbunătățește supraviețuirea într-un model murin de colită American Journal of

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Abstract

Inozina, o purină naturală formată din descompunerea adenozinei, s-a dovedit recent că exercită efecte antiinflamatoare puternice atât in vivo, cât și in vitro. Acest studiu a evaluat inozina ca o terapie potențială pentru colită. Colita a fost indusă la șoareci prin administrarea de dextran sulfat de sodiu (DSS). Tratamentul oral cu inozină a început fie înainte de apariția colitei, fie ca post-tratament, odată ce colita a fost stabilită. Evaluarea afectării și inflamației colonului a fost determinată grosolan (greutate corporală, sângerare rectală), histologic și biochimic (nivelurile de colon de MPO, MDA și citokine). Colita indusă de DSS a crescut semnificativ infiltrarea celulelor inflamatorii în colon. Colita indusă de DSS a crescut, de asemenea, nivelurile de colon de peroxidare a lipidelor, citokine și chemokine. Inozina a protejat colonul de infiltrarea celulelor inflamatorii induse de DSS și de peroxidarea lipidelor. De asemenea, inozina a redus parțial acești parametri într-un model experimental de colită stabilită. Astfel, tratamentul cu inozină poate fi o terapie potențială în colită.

Reactivii au fost obținuți din următoarele surse: DSS (MW 40.000) a fost de la ICN Pharmaceuticals; inozină, MPO uman, 1,1,3,3-tetrametoxipropan, acid tiobarbituric, dodecil sulfat de sodiu, tetrametilbenzidină, bromură de hexadeciltrimetilamoniu și peroxid de hidrogen proveneau din Sigma (St. Louis, MO); Șoarecii BALB/c provin de la Taconic Farms (Germantown, NY); și kituri specifice ELISA pentru citokine au fost de la R&D Systems (Minneapolis, MN).

Inducerea colitei și tratament.

Șoareci masculi BALB/c, cu vârsta de 8 săptămâni, cu o greutate de 20-23 g au fost folosiți pentru aceste studii. Animalele sunt adăpostite în încăperi la o temperatură controlată și un ciclu lumină-întuneric timp de 48 de ore înainte de a începe protocoalele experimentale. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu „Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator” [Publicația DHEW nr. (NIH) 85-23, revizuit 1985, Biroul de științe și rapoarte de sănătate, DRR/NIH, Bethesda, MD 20205] și cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Inotek.

Șoarecii au fost hrăniți cu 5% DSS, masă moleculară 30-40 kDa dizolvată în apă distilată ad libitum pe tot parcursul experimentului (31). Inozina a fost administrată pe cale orală prin gavaj sau intraperitoneal de două ori pe zi. Șoarecii martori au fost tratați cu vehicul, care a fost fie apă pentru protocolul experimental de inozină orală, fie soluție salină pentru protocolul experimental de inozină intraperitoneală. Pentru experimentele de tratament cu inozină întârziată, șoarecilor li s-a administrat vehicul până în ziua în care a început tratamentul cu inozină. Inozina a fost administrată la doze cuprinse între 25 și 200 mg · kg -1 -1 zi -1 și s-a bazat pe studii recente de testare a inozinei pe modele de inflamație la rozătoare (14, 18, 25). Aportul soluției DSS a fost monitorizat pe parcursul experimentelor și sa dovedit a fi neschimbat în rândul grupurilor experimentale (datele nu sunt prezentate).

Evaluarea severității colitei și a efectelor medicamentoase.

Parametrii înregistrați în experimente au fost greutatea corporală, lungimea colonului, mortalitatea și sângerarea din rect, determinate de inspecția oculară. Șoarecii au fost cântăriți zilele 1 și 10cu modificarea ulterioară a greutății indusă de colită exprimată ca procent din greutatea inițială. Șoarecii au fost uciși prin luxație cervicală, iar colonul a fost rezecat între joncțiunea ileocecală și rectul proximal, aproape de trecerea sa sub pelvistern. Colonul a fost plasat pe o suprafață neabsorbantă și măsurat cu o riglă. Biopsiile colonice au fost luate pentru analize histologice și biochimice. O biopsie a fost fixată în 15% formaldehidă, încorporată în parafină și secționată (felii de 4 μm). Secțiunile au fost apoi colorate cu hematoxilină și eozină și vizualizate de un investigator (orbit) și au fost punctate pentru severitatea inflamației (0 = niciuna, 1 = ușoară, 2 = moderată și 3 = severă) și extinderea (0 = niciuna, 1 = mucoasă, 2 = mucoasă și submucoasă și 3 = transmurală, precum și deteriorarea criptelor (0 = niciuna, 1 = 1/3 bazală, 2 = 2/3 bazală, 3 = criptele pierdute prezente epiteliu și 4 = criptele și epiteliul de suprafață pierdut), cu secțiuni reprezentative afișate aici.

Activitatea MPO.

Biopsiile de colon au fost omogenizate (50 mg/ml) în bromură de hexadeciltrimetilamoniu 0,5% în 10 mM MOPS și centrifugate la 15.000 g timp de 40 min. Suspensia a fost apoi sonicată de trei ori timp de 30 de secunde. O alicotă a supernatantului (20 pl) a fost amestecată cu o soluție de 1,6 mM tetrametilbenzidină și 1 mM peroxid de hidrogen. Activitatea a fost măsurată spectrofotometric ca schimbarea absorbanței la 650 nm la 37 ° C, folosind un cititor de microplăci Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Rezultatele sunt exprimate ca miliunități de activitate MPO per miligram de proteine, care au fost determinate cu testul Bradford.

Test de malondialdehidă.

Formarea malondialdehidei a fost utilizată pentru a cuantifica peroxidarea lipidelor în colon și a fost măsurată ca material reactiv la acid tiobarbituric. Țesuturile au fost omogenizate (100 mg/ml) în tampon KCl 1,15%. Două sute de microlitri de omogenate au fost apoi adăugate la un amestec de reacție format din 1,5 ml acid tiobarbituric 0,8%, 200 μl 8,1% dodecil sulfat de sodiu, 1,5 ml acid acetic 20% (pH 3,5) și 600 μl H2O distilat. Amestecul a fost apoi încălzit la 90 ° C timp de 45 min. După răcire la temperatura camerei, probele au fost eliminate prin centrifugare (10.000 g, 10 min) și absorbanța lor a fost măsurată la 532 nm folosind 1,1,3,3-tetrametoxipropan ca standard extern. Nivelul peroxizilor lipidici a fost exprimat ca nanomoli MDA pe miligram de proteine (test Bradford).

Nivelurile de citokine ale colonului.

O a treia biopsie a colonului a fost îndepărtată și a fost congelată în azot lichid, proba a fost apoi omogenizată în 700 pl dintr-un tampon Tris · HCI conținând inhibitori de protează. Probele au fost centrifugate timp de 30 de minute și supernatantul a fost înghețat la -80 ° C până la testare. Nivelurile de citokine au fost determinate utilizând ELISA.

analize statistice.

Rezultatele sunt prezentate ca mijloace ± SE; analiza statistică a fost preformată folosind fie ANOVA unidirecțională, urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc, testul exact al lui Fisher, Mann-Whitney U-test, sau analiza supraviețuirii Kaplan-Meier, după caz, cu un valoarea −1 · zi −1 inozinei intraperitoneal, respectiv. În mod similar, sângerarea rectală a fost redusă semnificativ de la 60 la 10 și 0%. De asemenea, am examinat nivelurile de colon ale MPO și MDA; în ambele cazuri, inozina a redus semnificativ nivelurile în comparație cu animalele tratate cu vehicule. Nivelurile MPO au fost reduse de la 337 ± 60 la 101 ± 21 și 69 ± 16 mU/mg proteină cu 100 sau 200 mg · kg -1 -1 zi-1 tratament cu inozină. În mod similar, nivelurile de MDA au fost reduse de la 3,5 ± 0,5 la 1,9 ± 0,3 nmol/mg proteină cu 200 mg · kg -1 · zi -1 inozină. Nivelul MDA în colon după 100 mg · kg -1 -1 zi-1 ip inozină a fost de 2,5 ± 0,4 nmol/mg proteină, ceea ce nu a fost semnificativ diferit statistic de colonul tratat cu vehicul.