Transglutaminază de țesut uman recombinant pentru diagnosticarea și urmărirea bolii celiace din copilărie
Abstract
Pentru identificarea copiilor cu leziuni precoce ale mucoasei și pentru urmărirea rapidă sunt necesari markeri extrem de discriminatori pentru boala celiacă. Scopul acestui studiu a fost de a evalua potențialul anticorpilor IgA și IgG anti-țesut transglutaminază circulanți (tTG) în diagnosticul și urmărirea bolii celiace din copilărie. Un ELISA care utilizează tTG uman recombinant a fost utilizat pentru a măsura nivelurile de anticorpi anti-tTG IgA și IgG în 226 probe de ser de la 57 de copii cu boală celiacă verificată de biopsie, 29 de subiecți de control al bolii și 24 de subiecți de control sănătoși. Toate probele au fost, de asemenea, analizate pentru anticorpi anti-endomisiu (EMA). Nivelurile de anticorpi IgA și IgG anti-tTG corelate cu starea structurii viloase a intestinului subțire și nivelurile serice ale IgA EMA. Toate cele 25 de probe de ser obținute de la pacienți netratați conțineau anticorpi IgA anti-tTG, iar 24 din 25 aveau, de asemenea, IgA EMA. Dintre probele de ser de la 53 de copii martori, doi aveau anticorpi IgA anti-tTG și doi aveau IgA EMA. Copiii cu vârsta sub 5 ani cu boală celiacă netratată au avut cele mai ridicate niveluri serice atât de IgA cât și de IgG anti-tTG. A existat deja o creștere a anticorpilor anti-tTG IgA după 2 săptămâni de provocare cu gluten (
Pacienții cu boală celiacă prezintă un spectru larg de diferite simptome nespecifice, iar descrierea clasică a bolii este probabil doar un capăt al spectrului larg de tulburări induse de gluten. Prin definiție, o biopsie din intestinul subțire proximal este esențială pentru diagnostic, iar boala celiacă este verificată cu cel puțin o biopsie intestinală care prezintă atrofie viloasă (1). Prin urmare, apar dificultăți de diagnostic atunci când se observă doar modificări patologice minore în morfologia mucoasei sau o densitate crescută a IEL.
Nivelurile crescute de IgA și IgG AGA și IgA EMA circulante sunt frecvente la pacienții cu boală celiacă, iar evaluarea acestor anticorpi este, în general, utilizată ca ajutor în diagnostic (2). Cu toate acestea, unii pacienți celiaci nu au niveluri crescute de AGA și EMA și, atunci când sunt crescute, diferitele niveluri de anticorpi scad lent, fiind reduse doar după 3-12 luni de restricție a glutenului (3).
tTG a fost identificat în 1997 ca principalul antigen țintă pentru anticorpii endomiziali (4). TTG a fost demonstrat în multe țesuturi umane diferite, cum ar fi pielea, ficatul și mucoasa jejunală (5). TTG este implicat în aderența celulară, asamblarea matricei extracelulare și mecanismele de vindecare a rănilor (6-8), iar gliadinele din grâu pot acționa ca substrat pentru reacțiile transglutaminazei (9, 10). De asemenea, s-a arătat că tTG deamidează selectiv peptidele gliadinei, ceea ce duce la o reactivitate puternic crescută a celulelor T derivate din intestin specific gliadinelor (11, 12).
Măsurătorile anticorpilor IgA serici împotriva tTG pot fi utilizate ca markeri sensibili și specifici pentru boala celiacă netratată. Testele pentru detectarea anticorpilor anti-tTG IgA au o sensibilitate de 92 până la 100% și o specificitate de 90 până la 98% (13-20). Rapoarte recente au indicat că testele tTG pot fi îmbunătățite în continuare prin utilizarea tTG uman în loc de tTG porc de guineea (18, 20-22).
Cu toate acestea, există încă unele îndoieli cu privire la faptul că tTG uman recombinant poate fi utilizat cu aceeași sensibilitate diagnostică și precizie ca testul EMA și dacă tTG uman recombinant este un marker mai sensibil și specific decât EMA pentru boala celiacă la copiii mai mici. Prin urmare, am studiat un grup mare de copii cu boală celiacă verificată de biopsie și am controlat subiecții cu alte boli gastro-intestinale pentru a investiga potențialul clinic al tTG uman recombinant în diagnosticul și urmărirea bolii celiace din copilărie.
METODE
Pacienți.
În acest studiu au fost incluși 86 de copii cu simptome gastro-intestinale și suspiciune de malabsorbție. Boala a fost diagnosticată la toți copiii de la Departamentul de Pediatrie, Spitalul Universitar Uppsala, iar în cursul anchetei boala celiacă a fost evidentă la 57 de copii (31 fete, 26 băieți; vârsta mediană, 4 ani; interval, 1-16 ani). Diagnosticul a fost confirmat în conformitate cu criteriile inițiale ale Societății Europene pentru Gastroenterologie Pediatrică, Hepatologie și Nutriție (ESPGHAN) (23) sau conform criteriilor revizuite pentru diagnosticarea bolii celiace la copii.
Au fost efectuate biopsii ale intestinului subțire la toți copiii și au fost incluse în acest studiu 25 de biopsii de la pacienți netratați, 21 de biopsii după 1-3 ani pe o dietă fără gluten și 38 de biopsii după 12 săptămâni de GC. Patruzeci dintre copiii celiaci au primit o probă de sânge după 2 săptămâni de GC. Toți copiii provocați au avut o dietă normală care conține gluten, cu recomandarea ca sarcina zilnică de gluten să fie cel puțin echivalentă cu 2-3 bucăți de pâine.
După o examinare diagnostică extinsă, 29 de copii (16 fete, 13 băieți; vârsta medie, 5 ani; interval, 1-18 ani) s-au dovedit a avea alte tulburări decât boala celiacă. În acest grup de control al bolii, doi au avut boli inflamatorii intestinale, nouă au avut intoleranță la laptele de vacă, trei au avut alte intoleranțe alimentare și 15 au avut tulburări gastro-intestinale tranzitorii. Toți subiecții de control al bolii au suferit o biopsie a intestinului subțire și au fost incluse 24 de biopsii în studiu.
Douăzeci și patru de copii (11 fete, 13 băieți; vârsta medie, 5 ani; interval, 1-16 ani) fără simptome gastro-intestinale și fără rude cu boală celiacă au servit drept subiecți de control sănătoși. Toate studiile la pacienți și subiecți de control au fost efectuate în conformitate cu regulile etice ale spitalului.
Anticorpi anti-tTG.
Anticorpii IgA și IgG la tTG în ser au fost determinați cu un ELISA (prototip de cercetare, Pharmacia Diagnostics, Freiburg, Germania). S-au utilizat benzi de microplacă acoperite cu tTG uman recombinant produse în sistemul Baculo/Sf9 la concentrație optimă. TTG uman recombinant a avut o puritate de 99% și a inhibat legarea endomizială IgA de la serul pacientului cu boală celiacă la esofagul maimuțelor mai eficient decât tTG la cobai și a dat o inhibare echivalentă tTG-ului nativ din eritrocitele umane (24).
Serurile pacienților au fost diluate în PBS cu 1% BSA și 0,1% azidă de sodiu (PBS-BSA) la concentrații adecvate. S-a adăugat ser de pacient (100 μL) și benzile au fost incubate timp de 30 min la temperatura camerei și spălate de trei ori cu PBS. S-a adăugat peroxidază de hrean - anticorpi anti-IgA sau IgG anti-umani conjugați și după 30 de minute la temperatura camerei plăcile au fost spălate de trei ori.
S-a adăugat o soluție de substrat care conține 3,3 ′, 5,5 ′ tetrametilbenzidină și reacția a fost oprită după 10 minute la temperatura camerei cu 0,5 M H2SO4. Absorbanta a fost masurata la 450 nm.
Calibratori de anticorpi IgA anti-tTG, un control negativ și semifabricate diluante au fost incluși în fiecare test. Concentrațiile de anticorpi au fost exprimate ca UA pe mililitru, iar probele de ser cu absorbanțe peste cel mai mare calibrator au fost diluate în continuare și reevaluate. Variațiile intra și interanalize au fost mai mici de 10%.
Limita pentru testele tTG a fost determinată de curbele caracteristice de funcționare a receptorului (25), iar nivelurile de tăiere au fost de 4,7 AU/mL pentru testul IgA tTG și 1,2 AU/mL pentru testul IgG tTG.
Analiza EMA.
IgA EMA au fost analizate prin microscopie indirectă de imunofluorescență utilizând secțiuni fixe de criostat de esofag de maimuță (Scimedx, Densville, NJ, S.U.A.) ca substrat antigenic (26). Serurile pacienților au fost diluate 1/10, iar serurile pozitive au fost, de asemenea, investigate la diluții de 1/50, 1/100, 1/500 și 1/1000. Titrul anticorpului a fost definit ca cea mai mare diluție serică care produce fluorescență.
Celule producătoare de AGA.
Celulele mononucleare din sângele periferic au fost obținute din sânge venos heparinizat prin separare pe Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia). Fenotipul celular a fost determinat prin analiza de sortare a celulelor activată prin fluorescență și 6 până la 22% din celulele mononucleare erau CD45 + CD19 + (citometru de flux FACSscan și MAb de la Becton Dickinson, San Jose, CA, S.U.A.).