Suprimarea eliberării peptidei de tip glucagon (GLP) -1 a celulelor enteroendocrine de către mic indusă de grăsime

Chirurgia de by-pass gastric Roux-en-Y pentru obezitate are efecte rapide, nedependente de greutate, asupra metabolismului glucozei, care nu pot fi explicate doar prin înfometarea perioperatorie.

Care sunt noile descoperiri?

Ketogeneza intestinală, indusă de hrănirea prelungită cu conținut ridicat de grăsimi, poate fi un mecanism de reacție bontă la GLP-1 la subiecții obezi înainte de operație. După o intervenție chirurgicală de bypass gastric, acest mecanism poate fi ameliorat prin inhibarea ketogenezei intestinale, promovând îmbunătățirea rapidă a răspunsului GLP-1 după operație.

Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul previzibil?

Poate fi posibil să se țintească farmaceutic ketogeneza intestinală și astfel să se contracareze efectul diabetogen al obezității fără a fi nevoie de o intervenție chirurgicală de bypass gastric.

INTRODUCERE

By-passul gastric Roux-en-Y (RYGB) este eficient în tratamentul pe termen lung al obezității morbide și al diabetului de tip 2.1 Pierderea în greutate în sine este un factor important în spatele îmbunătățirii stării metabolice, dar RYGB activează, de asemenea, post-operatoria timpurie independentă de greutate mecanisme, de exemplu, eliberarea indusă de masă a peptidelor intestinale.2 3 Astfel de efecte asociate RYGB au evidențiat efectele reconfigurării anatomice a tractului alimentar în metabolismul întregului corp. Prin urmare, am folosit RYGB ca model pentru a încerca să găsim noi mecanisme intestinale asociate în intestinul subțire proximal pentru îmbunătățirea metabolismului glucozei.

Materiale și metode

Chirurgie și pacienți

Material suplimentar

Caracteristicile pacientului în proteomică, confirmare și grupuri de dietă

Analiza globală a expresiei proteinelor a mucoasei jejunale umane

Tehnica a fost descrisă mai devreme.11 Doar proteinele fiind modificate în mod constant la toți pacienții și cu o schimbare de cel puțin 50% față de valoarea inițială au fost incluse pentru o analiză ulterioară.

Studii pe animale

Șoareci masculi C57BL/6J de patru săptămâni până la 5 săptămâni au fost cumpărați de la Harlan (Horst, Olanda). Animalele au fost menținute sub temperatură controlată (23 ° C) și lumină (luminile aprinse, 06: 30–18: 30 ore), cu acces ad libitum la apă și alimente peletate (R34 Lactamin, Kimstad, Suedia) cu un conținut de nutrienți de g %: grăsimi 4%, proteine 16,5%, carbohidrați 58,0%; conținut caloric total: 3 kcal/g. Începând cu vârsta de 6 până la 8 săptămâni șoarecii au fost hrăniți cu HFD sau cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD) timp de 3 săptămâni sau 3 luni. HFD consta din alimente peletate (Surwit Diabetogenic Rodents Diet, D12309; Research Diets, New Brunswick, New Jersey, SUA) și avea un conținut de nutrienți în g%: grăsimi 35,9%, proteine 23%, carbohidrați 35,5%; conținut caloric total: 5,6 kcal/g. Animalele LFD au continuat să primească dieta obișnuită (R34).

În primul set de experimente șoarecii au fost sacrificați după 3 săptămâni de LFD sau HFD și diferite părți ale intestinului subțire; au fost prelevate duoden (proximal 3 cm), jejun (mijloc 3 cm) și ileon (distal 3 cm), precum și ficatul. Probele cu grosime completă de perete intestinal și un lob hepatic au fost înghețate rapid în azot lichid și menținute congelate (-70 ° C) pentru analiza ulterioară a expresiei proteinelor prin Western blot (vezi mai jos).

Într-un al doilea set de experimente șoarecii au fost hrăniți cu LFD sau HFD timp de 3 luni. În ziua studiului, alimentele au fost îndepărtate timp de 45 de minute înainte de experimentare pentru a sincroniza starea de hrănire. La începutul experimentului a fost administrat un gavaj oral cu 250 ofL de Intralipid (ulei de soia 200 mg/ml, fosfolipide de ou purificate, glicerol, hidroxid de sodiu, apă; Fresenius Kabi, Suedia), conținând oricare dintre vehicule (20 µL de acetat de etil ), 2,5 mg de inhibitor al 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintazei mitocondriale (mHMGCS) himeglusină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, SUA; dizolvat în vehicul) sau 25 mg de β-hidroxibutirat (βHB, Sigma- Aldrich, St Louis, MO; dizolvat în vehicul). La 15, 30 sau 120 min, probele de sânge venos au fost preluate din coadă și βHB a fost analizată folosind un senzor GlucoMen LX β-cetonă (A. Menarini Diagnostics, Firenze, IT).

Într-un al treilea set de experimente șoarecii au fost ținuți pe LFD sau HFD timp de 3 săptămâni și au postit timp de 6 ore înainte de începerea experimentului. Apoi a fost administrat un gavaj oral cu 500 ofL de Intralipid (Fresenius Kabi) și după încă 90 de minute șoarecii au fost anesteziați folosind izofluran. A fost efectuată o laparotomie, iar vena portă a fost identificată și perforată cu ajutorul unui ac subțire și s-a colectat sânge. Probele de sânge periferic au fost extrase concomitent din ochi. Probele de sânge au fost centrifugate pentru a prepara serul. βHB a fost analizat în ser folosind un kit EnzyChrom Ketone Body Assay (BioAssay Systems, Hayward, California, SUA).

Omogenizarea biopsiei, Western blot și cuantificarea βHB

Pentru toate cohortele umane și toate specimenele de mucoasă jejunală congelată murină, probele de țesut au fost preparate așa cum s-a descris mai sus.11 Pentru fiecare bandă detectată, densitatea a fost cuantificată și exprimată ca procent din densitățile totale ale tuturor benzilor de acea dimensiune specifică pe aceeași membrană. Gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca control al încărcării. Pentru anticorpi, a se vedea tabelul suplimentar 1 online.

Material suplimentar

Pentru cuantificarea βHB, omogenizările tisulare peri-RYGB și post-RYGB din „cohorta dietei” au fost analizate folosind kitul de testare colorimetrică βHB (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, SUA) și rezultatele normalizate pentru a omogeniza conținutul de proteine.

Histologia mucoasei jejunale umane

Specimenele de mucoasă jejunală preluate de la pacienții peri-RYGB și post-RYGB (n = 5, selecție aleatorie din cohorta de confirmare) au fost prelucrate în conformitate cu procedurile standard pentru prepararea probei de histologie. Pe scurt, biopsiile au fost fixate în formaldehidă 4% tamponată cu fosfat, deshidratate și încorporate în parafină. Biopsiile încorporate au fost tăiate în 5 secțiuni m secțiuni. Pentru imunofluorescență, secțiunile au fost rehidratate, antigenele au fost recuperate și secțiunile au fost blocate în ser normal de capră 5% (31872, ThermoFisher Scientific, Rockford, Illinois, SUA) înainte de incubare cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C. Lamele au fost apoi spălate și incubate cu anticorpul secundar timp de 2 ore la temperatura camerei și contracolorate cu colorare Hoechst (H6024, Sigma-Aldrich). Pentru anticorpi vezi tabelul suplimentar online 1. Secțiunile cu tampon de blocare în locul anticorpului primar au fost incluse ca martori negativi. Pentru histologie generală, colorarea H&E a fost efectuată conform procedurilor standard.