Metalotioneina previne dieta bogată în grăsimi - diabet zaharat cu disfuncție contractilă cardiacă indusă

Rolul proliferatorului Peroxisomului - Receptor activat γ Coactivator 1α și Biogenezei mitocondriale

  1. Feng Dong,
  2. Qun Li,
  3. Nair Sreejayan,
  4. Jennifer M. Nunn și
  5. Jun Ren
  1. De la Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare și Medicină Alternativă, Universitatea din Wyoming, Laramie, Wyoming
  1. Adresați cererile de corespondență și reimprimare către Dr. Jun Ren, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare și Medicină Alternativă, Universitatea din Wyoming, Laramie, WY 82071. E-mail: jrenuwyo.edu

Rolul proliferatorului Peroxisomului - Receptor activat γ Coactivator 1α și Biogenezei mitocondriale

Abstract

  • EDD, diametru end-diastolic
  • ESD, diametru sistolic final
  • FFI, intensitatea fluorescenței fura-2
  • ADNmt, ADN mitocondrial
  • mtTFA, factorul de transcripție mitocondrială A
  • NRF, factor respirator nuclear
  • PGC-1α, proliferator de peroxizom - receptor activat γ coactivator-1α
  • ROS, specii reactive de oxigen
  • Sirt, regulator de informații silențios
  • TPS, timpul până la scurtarea vârfului
  • TR90, timp până la 90% întărire

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Hrana cu diete bogate în grăsimi și testul de toleranță la glucoză intraperitoneală.

Procedura experimentală descrisă aici a fost aprobată de comitetul nostru instituțional de utilizare și îngrijire a animalelor. Pe scurt, șoarecii transgenici de supraexpresie metalotioneină specifică cardiacei masculi în vârstă de 4 luni și cântărind aproximativ 20 g au fost repartizați aleatoriu în dietele cu conținut scăzut de grăsimi (10% din calorii totale) sau bogate în grăsimi (45% din calorii totale) New Brunswick, NJ) timp de 5 luni. Dieta bogată în grăsimi a fost bogată caloric (4,83 vs. 3,91 kcal/g în dieta cu conținut scăzut de grăsimi) datorită compoziției mai mari de grăsimi. Cu toate acestea, cele două diete au avut o compoziție similară de nutrienți. Șoarecii au fost adăpostiți individual într-un mediu controlat de climat, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și acces gratuit la diete și apă. Culoarea blănii a fost utilizată ca marker pentru identificarea metalotioneinei (maro închis) sau FVB (alb) a mouse-ului. După 5 luni de hrănire, toți șoarecii au fost posti timp de 12 ore și apoi li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză (2 g/kg corp greutate). Probele de sânge au fost extrase din coadă imediat înainte de provocarea glucozei, precum și 15, 60 și 120 de minute după aceea. Nivelurile serice de glucoză au fost determinate utilizând un analizor de glucoză Accu-Chek III (15). Tensiunea arterială sistolică și diastolică a fost examinată cu un dispozitiv semi-automat, amplificat cu manșetă de coadă. Nivelurile de insulină din sânge au fost măsurate folosind un set de test imunosorbent legat de enzima insulinei de șoarece.

grăsimi

Evaluarea ecocardiografică.

Geometria și funcția cardiacă au fost evaluate la șoareci anesteziați (Avertin 2,5%, 10 μl/g corp greutate i.p.) folosind o ecocardiografie ghidată bidimensională în mod M (Sonos 5500) echipată cu un traductor liniar de 15-6 MHz. Grosimea peretelui anterior și posterior și dimensiunile diastolice și sistolice ale ventriculului stâng au fost înregistrate din imagini în modul M folosind metoda adoptată de Societatea Americană de Ecocardiografie. Scurtarea fracțională a fost calculată din diametrul end-diastolic (EDD) și diametrul end-sistolic (ESD) utilizând următoarea ecuație: (EDD - ESD)/EDD. Ritmul cardiac a fost calculat în medie pe 10 cicluri cardiace (16).

Izolarea cardiomiocitelor.

După sedarea ketaminei/xilazinei, inimile au fost îndepărtate și perfuzate cu tampon bicarbonat Krebs-Henseleit (KHB) conținând (în mmol/l): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES și 11,1 glucoză. Inimile au fost digerate cu colagenază D timp de 20 de minute. Ventriculele stângi au fost îndepărtați și tocați înainte de a fi filtrate. Randamentul miocitelor a fost de ~ 75% și nu a fost afectat de dieta bogată în grăsimi sau de metalotioneină. Doar miocitele în formă de tijă cu margini clare au fost selectate pentru studiul mecanic și intracelular Ca 2+ (15).

Scurtarea/întărirea celulei.

Proprietățile mecanice ale cardiomiocitelor au fost evaluate utilizând un sistem cu margini moi IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Miocitele au fost plasate într-o cameră montată pe stadiul unui microscop Olympus IX-70 și superfuzate (± 2 ml/min la 25 ° C) cu un tampon de bicarbonat Krebs-Henseleit conținând 1 mmol/l CaCl2. Miocitele au fost stimulate în câmp la 0,5 Hz, dacă nu se specifică altfel. Scurtarea și întărirea celulelor au fost evaluate, inclusiv scurtarea vârfurilor, indicând contractilitatea maximă; time-to-PS (TPS), indicând durata contracției; întărirea timpului până la 90% (TR90), indicând durata relaxării; și viteze maxime de scurtare/întărire (± dL/dt), indicând dezvoltarea și declinul presiunii maxime (15).

Tranzitori intracelulari Ca 2+.

O cohortă de miocite a fost încărcată cu fura-2/AM (0,5 μmol/l) timp de 10 minute, iar intensitatea fluorescenței a fost înregistrată cu un sistem de fotomultiplicare cu fluorescență cu dublă excitație (Ionoptix). Miocitele au fost plasate pe un microscop inversat Olympus IX-70 și au fost realizate printr-un obiectiv Fluor × 40 cu ulei. Celulele au fost expuse la lumina emisă de o lampă de 75W și au trecut fie printr-un filtru de 360, fie de 380 nm, în timp ce au fost stimulate să se contracte la 0,5 Hz. Emisiile de fluorescență au fost detectate între 480 și 520 nm, iar schimbarea calitativă a intensității fluorescenței fura-2 (FFI) a fost dedusă din raportul FFI la cele două lungimi de undă (360/380). Timpul de descompunere a fluorescenței (decădere simplă sau bi-exponențială) a fost calculat ca indicator al compensării intracelulare a Ca 2+ (15).

Analiza producției ROS.

Producția de ROS celular a fost evaluată prin analiza modificărilor intensității fluorescenței rezultate din oxidarea fluoroprobei intracelulare DCF [5- (6) -chlorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceină diacetat]. Pe scurt, cardiomiocitele au fost încărcate cu 10 μmol/l DCF la 37 ° C timp de 30 de minute. Miocitele au fost clătite și intensitatea fluorescenței a fost apoi măsurată folosind un cititor de microplacă fluorescentă la o lungime de undă de excitație de 480 nm și o lungime de undă de emisie de 530 nm. Celulele netratate nu au prezentat fluorescență și au fost utilizate pentru a determina fluorescența de fond (17).

Microscopie electronică de transmisie.

Ventriculii stângi au fost fixați cu 2,5% glutaraldehidă/1,2% acroleină în tampon fixativ (0,1 mol/l cacodilat, 0,1 mol/l zaharoză, pH 7,4) și 1% tetroxid de osmiu, urmat de 1% acetat de uranil, și deshidratat printr-o serie gradată de concentrații de etanol înainte de a fi încorporate în rășina LX112 (LADD Research Industries, Burlington, VT). Secțiuni ultra-subțiri (~ 50 nm) au fost tăiate pe ultramicrotom, colorate cu acetat de uranil urmat de citrat de plumb și vizualizate pe un microscop electronic cu transmisie Hitachi H-7000 echipat cu o cameră digitală cu dispozitiv cuplat cu încărcare răcită 4K × 4K (18 ). Analizele cantitative ale dimensiunii și densității mitocondriale au fost efectuate la o mărire de × 4.000. O medie de șase până la șapte câmpuri vizuale a fost evaluată pentru fiecare inimă de șoarece.