Interleukina-6 induce pierderea de grăsime în cașexia cancerului prin promovarea lipolizei țesutului adipos alb și

Abstract

fundal

Cașexia cancerului este un sindrom metabolic progresiv și multifactorial caracterizat prin pierderea țesutului adipos și a mușchiului scheletic. Se propune lipoliza țesutului adipos alb (WAT) și transdiferențierea alb-maronie a WAT (rumenirea WAT) pentru a contribui la atrofia WAT în cașexia cancerului. S-a raportat că inflamația cronică, mediată de citokine, cum ar fi factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α) și interleukina-6 (IL-6), promovează cașexia cancerului. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă inflamația cronică promovează cașexia cancerului prin reglarea metabolismului WAT și a mecanismului de bază.

Metode

În acest studiu, am analizat mai întâi asocierea dintre inflamația cronică și metabolismul WAT la pacienții cahectici cu cancer gastric și colorectal. La șoarecii cahectici tratați cu anticorp anti-receptor IL-6, am clarificat dacă lipoliza WAT și rumenirea au fost reglementate de IL-6.

Rezultate

Analizele clinice au arătat o asociere pozitivă semnificativă între IL-6 seric și acidul gras liber (FFA) atât în cașexia cancerului în stadiu incipient, cât și în stadiu târziu. Cu toate acestea, TNF-α seric a fost asociat pozitiv cu FFA seric în cașexia în stadiu incipient, dar nu în stadiu târziu. Lipoliza WAT a fost crescută în cașexia în stadiu timpuriu și târziu, în timp ce rumenirea WAT a fost detectată numai în cașexia în stadiu târziu. Anticorpul anti-receptor IL-6 a inhibat lipoliza WAT și rumenirea la șoarecii cahectici.

Concluzii

Pe baza acestor constatări, concluzionăm că inflamația cronică (în special cea mediată de IL-6) ar putea promova cașexia cancerului prin reglarea lipolizei WAT în cașexia în stadiu incipient și rumenirea în cașexia în stadiu târziu.

fundal

Cașexia cancerului este un sindrom de irosire definit de pierderea continuă a mușchilor scheletici și a masei grase care nu poate fi complet inversată prin sprijinul nutrițional convențional [1]. Cașexia cancerului apare la aproximativ 80% dintre pacienții cu cancer și este principala cauză de deces la 22-30% dintre toți pacienții cu cancer [2, 3]. Cașexia cancerului reduce semnificativ toleranța la terapia antineoplazică și scade calitatea vieții [4, 5]. Cu toate acestea, pacienții cu cancer nu sunt diagnosticați de obicei cu cașexie până când nu au pierdut mai mult de 5-7% din masa corporală din cauza lipsei unor markeri eficienți de detectare timpurie [6]. Prin urmare, există o nevoie urgentă de a înțelege mecanismele care stau la baza cașexiei cancerului pentru a informa dezvoltarea de noi ținte diagnostice și terapeutice.

Deși pierderea mușchilor este semnul distinctiv al cașexiei cancerului, factorul de bază catabolic al cașexiei cancerului cuprinde mai mult decât simpla descompunere proteolitică a proteinelor musculare contractile. Epuizarea țesutului adipos contribuie, de asemenea, la impactul devastator al cașexiei cancerului [7]. S-a raportat că pierderea țesutului adipos este asociată cu o calitate a vieții redusă și o supraviețuire mai scurtă, independent de indicele de masă corporală (IMC), la pacienții cu cancer avansat [8, 9]. Creșterea lipolizei și a oxidării grăsimilor, scăderea lipogenezei, afectarea depunerii lipidelor și a adipogenezei, precum și rumenirea țesutului adipos alb (WAT) pot sta la baza atrofiei adipoase în cașexia cancerului [10].

Inflamația cronică mediată de interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α) a fost investigată pe scară largă ca un important regulator al irosirii grăsimilor în cașexia cancerului [3, 10]. Cu toate acestea, relația dintre citokinele inflamatorii și lipoliza WAT și rumenirea la pacienții cu cahectică a fost, de asemenea, rar raportată. Rămâne însă neclar dacă citokinele inflamatorii contribuie la epuizarea adiposului în cașexia cancerului prin accelerarea lipolizei WAT și a rumenirii.

În studiul de față, am detectat lipoliza și rumenirea WAT în WAT subcutanat la pacienții cahectici cu cancer gastric și colorectal. Relația dintre citokinele inflamatorii și lipoliza WAT și rumenire au fost, de asemenea, analizate la pacienții cu cahectică. Efectul IL-6 asupra lipolizei și rumenirii WAT a fost analizat la șoareci cahectici.

Metode

Pacienți și colectarea probelor

WAT subcutanat au fost colectate în timpul intervenției chirurgicale de la pacienții cu cancer gastric și colorectal la Spitalul Zhongshan al Universității Fudan în perioada 1 ianuarie 2014 - 31 decembrie 2016. Diagnosticele bolii maligne au fost confirmate prin examinări patologice postoperatorii. Criteriile de excludere au fost după cum urmează: 1) pacientul în vârstă de 10% în ultimele 6 luni.

WAT-urile subcutanate au fost tăiate în jumătăți și o bucată a fost imediat înghețată în azot lichid și depozitată la -80 ° C până la o analiză ulterioară, în timp ce cealaltă jumătate a fost fixată în formalină 10% și încorporată în parafină. Probele de sânge ale tuturor pacienților au fost colectate înainte de operație și imediat centrifugate la 3000 rpm timp de 15 minute la 4 ° C. Probele de ser au fost conservate la -80 ° C pentru analize suplimentare. S-au înregistrat caracteristicile clinice ale fiecărui pacient înainte de operație, inclusiv vârsta, sexul și IMC.

Model experimental și tratamente de cașexie

Șoarecii masculi BALB/c (6-8 săptămâni) cu o greutate de 16-20 g au fost achiziționați de la Shanghai Laboratory Animal Center, Academia Chineză de Științe. Șoarecii au fost adăpostiți la 22 ± 1 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au avut acces gratuit la apă și la dieta convențională. Șoarecii au fost aclimatizați la mediu timp de 1 săptămână înainte de începerea studiului. Toate manipulările animalelor au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare și reglementările privind utilizarea animalelor experimentale de către Academia Chineză de Științe. S-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor și pentru a utiliza doar numărul de animale necesar pentru a produce date științifice fiabile.

Celulele 26 din colon/clonă 20, despre care s-a raportat că induc cașexie severă la șoareci BALB/c prin inoculare subcutanată, au fost cultivate în mediu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 suplimentat cu 5% ser fetal bovin și 1% penicilină-streptomicină la 37 ° C și 5% CO2. Șoarecii au fost repartizați aleatoriu în trei grupuri experimentale: grupul de control, grupul purtător de tumori Colon 26 și grupul purtător de tumori tratat cu anticorpi anti-receptor IL-6 (eBiosciences, CA, SUA). În ziua de studiu 0, 1,0 × 106 celule suspendate în 100 μl soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) au fost injectate subcutanat în axila dreaptă a șoarecilor din grupul tratat cu anticorpi purtători de tumori și anti-IL-6. Un volum egal de PBS fără celule tumorale a fost injectat în grupul de control. În grupul tratat cu anticorp anti-receptor IL-6, fiecare șoarece a primit o injecție intraperitoneală de 10 μg anticorp monoclonal al receptorului anti-IL-6 diluat în 200 μl soluție salină normală la fiecare 2 zile. Grupurile martor și purtătoare de tumori au primit 200 μl PBS. În ziua 16, șoarecii au fost sacrificați prin dislocare cervicală. Au fost colectate și cântărite WAT subcutanat inghinal și epididimal, BAT interscapulară și mușchiul gastrocnemius. Probele au fost tăiate în jumătăți, prelucrate și depozitate așa cum s-a efectuat cu probe WAT umane.

Imunohistochimie și analiză morfologică

WAT-urile subcutanate umane și de șoarece încorporate în parafină au fost tăiate în secțiuni de 5 μm. Imunomarcarea UCP1 a tuturor țesuturilor a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [19]. Pe scurt, lamelele au fost deshidratate în alcooli clasificați și xilen. Recuperarea antigenului a fost efectuată cu tampon citrat 0,01 M la 95 ° C timp de 20 min la pH 6,0. Diapozitivele au fost incubate cu anticorpi primari diluați (anti-UCP1, diluții 1: 100) timp de 12 ore. Diapozitivele au fost apoi incubate cu anticorp secundar biotinilat timp de 1 oră, streptavidină marcată cu peroxidază timp de 15 min și diaminobenzidină și peroxid de hidrogen substrat cromogen plus amplificator de diaminobenzidină timp de 10 min, urmată de contracolorare cu hematoxilină Mayer. Imaginile au fost obținute cu un obiectiv obiectiv × 40. Dimensiunile adipocitelor WAT au fost urmărite și cuantificate manual cu ajutorul software-ului ImageJ.

Analiza PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din WAT subcutanat uman și de șoarece folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, CA, SUA) conform recomandărilor producătorului. Concentrațiile de ARN au fost cuantificate prin spectrofotometru NanoDrop 2000 și integritatea a fost determinată prin electroforeză pe gel. ADN-ul complementar a fost sintetizat dintr-un ARN total de 1 μg folosind kitul de sinteză ADNc (Takara, Dalian, Japonia) urmând protocoalele producătorului. Analiza expresiei genei a fost efectuată folosind mixul master PrimeScript RT (Takara, Dalian, Japonia) în sistemul StepOnePlus în timp real (Applied Biosystems, CA, SUA). Nivelurile relative de expresie genică au fost calculate folosind 2 -∆∆Ct și comparate cu 18sRNA ca control intern. Exemplele utilizate sunt prezentate în Tabelul 1.