Efectele surfactantului și ale unei proteaze hipertermabile asupra infectivității șoarecilor infectați cu scrapie

1 Școală Absolventă de Științe ale Vieții și Mediului, Universitatea Prefecturală din Kyoto, 1-5 Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Japonia

2 Departamente de Anatomie și Biologie Celulară, Facultatea de Medicină, Colegiul de Medicină din Osaka, 2-7 Daigaku-machi, Takatsuki, Japonia

3 Laborator de chimie biometabolică, Școala de Științe ale Sănătății, Facultatea de Medicină, Universitatea Ryukyus, 207 Uehara, Nishihara, Japonia

4 Departamentul de Științe ale Materialelor și Vieții, Școala Absolventă de Inginerie, Universitatea Osaka, 2-1 Yamadaoka, Suita, Japonia

Autor corespondent: Yuichi Koga
Departamentul de Științe ale Materialelor și Vieții
Școală postuniversitară de inginerie, Universitatea Osaka
2-1 Yamadaoka, Suite, Osaka 565-0871, Japonia
Tel: +81-6-6879-7443
Fax: +81-6-6879-7443
E-mail: [e-mail protejat]

Data primirii: 22 iulie 2015; Data acceptată: 25 august 2015; Data publicării: 31 august 2015

Citare: Hirata A, Sakudo A, Takano K, Kanaya S, Koga Y (2015) Efectele surfactantului și a proteazei hipertermabile asupra infectării omogenizării creierului de șoarece infectat cu scrapie. J Biotechnol Biomater 5: 194. doi: 10.4172/2155-952X.1000194

Vizitați pentru mai multe articole similare la Jurnal de biotehnologie și biomateriale

Abstract

PrP Sc este considerat a fi agentul infecțios al EST, iar inactivarea infectivității PrPSc fără utilizarea reactivilor puternici este dificilă. Deși PrPSc este o proteină rezistentă la protează, ea poate fi degradată in vitro de proteaza hipertermofilă (Tk-subtilisin) la temperaturi peste 65 ° C prin efectul sinergic al destabilizării termice a PrP și prin activitatea proteolitică ridicată a proteazei termostabile. Cu toate acestea, modificarea infecțiozității PrPSc protejat-digerat este încă necunoscută. Prin urmare, am folosit omogenat de creier de șoarece care conține PrPSc (SBH) într-un test biologic pentru a investiga pierderea infectivității după digestia Tk-subtilisinei. În mod surprinzător, SBH digerat cu Tk-subtilisină a păstrat un nivel ridicat de infectivitate. În ciuda acestui fapt, Tk-subtilisina ar putea fi încă utilizată pentru decontaminare în condiții de denaturare puternică a proteinelor, cum ar fi în prezența SDS.

Cuvinte cheie

Protează; Termostabil enzimă; Prion; Scrapie; Tksubtilisin

Abrevieri

PrP: Prion Prion; PrP Sc: PrP asociat scrapiei; PrP C: PrP celular; EST: Encefalopatie spongiformă transmisibilă; CJD: Boala Creutzfeldt - Jakob; SBH: Mouse Scrapie (Strain Chandler) Brain Homogenate; PK: Proteinaza K; SDS: Dodecil sulfat de sodiu; GdnHCI: clorhidrat de guanidină; TDT: Ditiotreitol; SDW: Apă distilată sterilizată

Introducere

O proteină prionică anormală cu o conformație bogată în foaie β, proteină prionică asociată cu scrapie (PrP Sc) [1], este componenta proteică majoră a unui prion infecțios asociat cu encefalopatii spongiforme transmisibile (EST) [2]. PrP se distinge de PrPC și PrP Sc prin infectivitatea sa și au proprietăți fizice diferite, cum ar fi sensibilitatea și solubilitatea Proteinazei K. PrP Sc este parțial rezistent la digestia Proteinazei K și favorizează formarea diferiților oligomeri [1,3]. PrP Sc se formează din PrPC prin schimbarea sa structurală de la o conformație bogată în α la o conformație bogată în β [4]. PrP Sc induce schimbarea structurală a PrPC prin legare și fiind un șablon al unei noi molecule PrP Sc. Astfel, PrP Sc este o moleculă proteică, care se auto-propagă [5-7].

Deoarece PrP Sc este rezistent la denaturarea termică la 121 ° C și la numeroase metode de decontaminare chimică, inactivarea PrP Sc este o țintă importantă de cercetare cu obiectivul prevenirii EST. Organizația Mondială a Sănătății recomandă o combinație de curățare, tratament chimic și sterilizare termică a echipamentelor medicale [8]. Mai precis, liniile directoare recomandă utilizarea unei autoclave și a unor tratamente chimice puternice, cum ar fi hidroxid de sodiu cu concentrație ridicată sau hipoclorit de sodiu, pentru instrumentele refolosibile. Deși aceste proceduri sunt eficiente pentru eliminarea infectivității, unele instrumente chirurgicale și complexe, cum ar fi endoscoapele cu fibră optică, nu pot fi decontaminate folosind aceste metode, deoarece ar putea fi deteriorate [9]. În plus, riscurile de siguranță asociate cu utilizarea substanțelor chimice puternice sunt de interes pentru comunitatea medicală [10]. Prin urmare, sunt necesare proceduri de decontaminare a prionilor cu o potență suficientă și o siguranță îmbunătățită [11].

Materiale și metode

Pregătirea proteazelor

Proteinaza K (PK) a fost achiziționată de la Wako Pure Chemicals Ltd, Osaka, Japonia. Tk-subtilisina a fost preparată din E. coli recombinant BL21 (DE3) adăpostind vectorul de expresie a genei Tk-subtilisină, așa cum sa descris anterior [14,17].

Pregătirea omogenizării creierului șoarecelui și Western blot

Omogenizarea creierului șoarecilor bolnavi terminal infectați cu tulpina Chandler de prion scrapie (SBH) a fost preparată la 10% (greutate/volum) în PBS steril. Concentrația de proteine a omogenatului a fost măsurată folosind un kit de testare a proteinelor DC (BioRad). Pentru a pregăti proba pentru degradarea PrP, o cantitate adecvată de omogenat, echivalentă cu 60 μg de proteină, a fost amestecată cu 0,5 M Tris-HCI (pH 8,0) și concentrațiile necesare de Tk-subtilisină și apă distilată, astfel încât totalul volumul a fost de 50 μL pentru fiecare afecțiune. S-a adăugat dodecil sulfat de sodiu (SDS) la 3% (greutate/volum), după cum este necesar. Probele rezultate au fost incubate la 100 ° C pentru timpul specificat. Când a fost necesară inactivarea Tk-subtilisinei, s-au adăugat 50 mM diisopropilfluorofosfat înainte de prepararea probei pentru electroforeza în gel de poliacrilamidă SDS (SDS-PAGE). A fost adăugat tampon de încărcare de două ori (150 mM Tris-HCI (pH 6,8), 6% (g/v) SDS, 30% (g/v) glicerol și 0,03% (g/v) albastru de bromofenol) și probele au fost fierte timp de 5 min. SDS-PAGE a fost efectuat folosind un gel de poliacrilamidă 15%, iar PrP a fost detectat prin Western Blot cu un anticorp anti-PrP, SAF83 (SPI bio, Montigny le Bretonneux, Franța).