Articolul complet Șoarecii C57BL6JRj de vârstă avansată nu dezvoltă obezitate la expunerea la dieta de tip occidental

Lucrare de cercetare

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

ABSTRACT

Obezitatea a devenit o amenințare globală pentru sănătate pentru fiecare grupă de vârstă. Este bine cunoscut faptul că șoarecii tineri (cu vârsta de 10-12 săptămâni) hrăniți cu o dietă de tip occidental (WD) devin obezi și dezvoltă niveluri mai ridicate de colesterol și steatoză hepatică, în timp ce sensibilitatea la insulină este redusă. Cu toate acestea, se știe mai puțin despre efectul unei WD asupra șoarecilor în vârstă. Prin urmare, șoarecii masculi C57BL/6JRj de 10 săptămâni (tineri) și 22 de luni (vârstă înaintată) au fost ținuți fie pe o dietă WD, fie pe o dietă de control (SFD) timp de 15 săptămâni. Spre deosebire de șoarecii tineri, șoarecii de vârstă avansată pe WD nu au prezentat o greutate corporală mai mare sau țesut adipos (AT), sugerând o protecție împotriva obezității induse de dietă. Mai mult, nivelurile plasmatice de adiponectină și leptină nu au fost afectate la alimentarea cu WD. Un WD, cu toate acestea, a indus o acumulare mai mare de lipide hepatice, precum și o expresie hepatică crescută a markerului macrofagului F4/80, la șoarecii în vârstă. Nu au existat diferențe semnificative în nivelurile de ARNm ale proteinei-1 sau F4/80 de decuplare în AT maro (BAT) sau a mai multor markeri de integritate intestinală din colon, sugerând că protecția împotriva obezității nu se datorează BAT excesive sau absorbției intestinale a grăsimilor . Astfel, șoarecii în vârstă, spre deosebire de omologii lor mai tineri, păreau a fi protejați împotriva obezității induse de dietă.

șoarecii

Introducere

Materiale și metode

Model animal

Publicat online:

Tabelul 1. Compoziția dietelor.

Analize

Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate utilizând benzi Glucocard (28.350, Menarini Diagnostics), iar trigliceridele plasmatice și colesterolul au fost evaluate utilizând teste clinice de rutină. Nivelurile de insulină plasmatică (Mercodia), adiponectină (sisteme R&D) și leptină (sisteme DY498, sisteme R&D) au fost măsurate utilizând ELISA disponibile în comerț. Indicele modelului homeostatic al rezistenței la insulină (HOMA-IR-) a fost calculat după cum urmează: nivelurile de glucoză la jeun (mM) x nivelurile de insulină la jeun (mU/L)/22,5. Conținutul de trigliceride din ficat și BAT a fost cuantificat cu kitul trigliceridelor FS * (Diasys), după prepararea țesutului hepatic așa cum s-a descris anterior [6]. Pe scurt, 30 mg țesut a fost incubat peste noapte la 55 ° C în KOH alcoolic (2: 3 60 ml EtOH 99% + 30 ml 30% KOH) până când digestia a fost completă. A doua zi, s-a adăugat 1 M MgCl2 (1: 1, vol/vol) la probele digerate. După 10 minute de incubație pe gheață și centrifugarea ulterioară, supernatantul a fost aspirat și analizat folosind kitul trigliceridelor FS * (Diasys). Nivelurile de lactat dehidrogenază (LDH) au fost evaluate utilizând setul de testare LDH (Abcam) conform instrucțiunilor producătorului.

Western blot

O Western blot pentru decuplarea proteinei-1 (UCP-1) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [7]. Pe scurt, țesutul adipos BAT a fost omogenizat utilizând ribolizorul FastPrep (MP Biomedicals) într-un tampon format din fosfat Na 10 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, 1% Triton, 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 0,5% Na deoxicolat, 0,2 % NaN3 și un cocktail inhibitor de protează (Thermo Fischer Scientific). Testul proteinei BCA (Pierce) a fost utilizat pentru a determina concentrația de proteine. O cantitate egală de proteină a fost apoi încărcată pe un SDS-PAGE de 10%. Gelurile au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză de 0,45 μm și blocate în lapte uscat fără grăsimi 5% (Bio-Rad) în tampon Tris-HCl 10 mM cu NaCl 150 mM și 0,5% Tween 20 pH 7,6 timp de 3 ore. În continuare, membrana a fost sondată cu un anticorp UCP-1 (Sigma-Aldrich). Pentru controlul încărcării, a fost utilizată β-actina. S-a adăugat apoi un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean în TBST care conține 5% lapte uscat fără grăsime. Semnalele au fost detectate folosind chemiluminescență îmbunătățită (Thermo Fischer Scientific). Analiza a fost efectuată cu imaginea J (NIH).

PCR în timp real

Testele de expresie a genei TaqMan (Thermo Fischer Scientific Inc.) au fost utilizate pentru a analiza nivelurile de ARNm ale mai multor gene din țesutul ficatului și colonului și BAT prin RT-PCR cantitativă (Tabelul 2), conform unui protocol descris anterior [8]. Pe scurt, extracția ARN din țesuturi a fost efectuată folosind mini kitul RNeasy (Qiagen, Basel, Elveția) conform instrucțiunilor producătorului. Zece nanograme/microlitru ARN au fost transcrise invers în ADNc folosind kitul Multiscribe ™ Reverse Transcriptase (Life Technologies, Thermo Fischer Scientific Inc.) conform protocolului producătorului. Detectorul de secvență rapidă ABI 7500 a fost utilizat pentru a efectua RT-PCR cantitativ. Datele au fost obținute ca valori ale pragului de ciclu (Ct) și normalizate la gena de menaj β-actină (∆Ct = Cttarget - Ctβ-actină). Pentru fiecare genă, au fost analizate două probe și valoarea medie Ct a fost calculată și utilizată pentru analiză. Diferențele de pliere în expresia genelor au fost calculate cu metoda ΔΔCt, folosind șoareci C57BL/6J păstrați pe SFD ca calibrator.

Publicat online:

Tabelul 2. Markeri detectați prin qPCR folosind teste de expresie a genei TaqMan.