Semnalizarea prin Tyr985 a receptorului de leptină ca un comutator dependent de AgeDiet în Regulamentul de

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Pentru corespondență: liuy @ sibs.ac.cncai_li @ merck.com

ABSTRACT

Leptina reglează homeostazia energetică prin activarea centrală a mai multor căi de semnalizare mediate de Ob-Rb, forma lungă a receptorului de leptină. Rezistența la leptină stă la baza dezvoltării patogene a obezității, care este strâns asociată cu factorii de mediu. Pentru a înțelege în continuare funcția fiziologică a mecanismelor de semnalizare a leptinei, am generat o linie knock-in de șoareci (Y985F) care exprimă un Ob-Rb mutant cu o substituție fenilalanină pentru Tyr 985, una dintre cele trei tirozine intracelulare care mediază acțiunile de semnalizare ale leptinei. În mod surprinzător, în timp ce animalele tinere homozigote Y985F erau ușor mai slabe, acestea prezintă obezitate la adulți sau indusă de dietă. Important, atât deteriorarea echilibrului energetic dependent de vârstă, cât și cea indusă de dietă a fost paralelă cu rezistența pronunțată la leptină, care a fost atribuită în mare măsură atenuării activării STAT3 hipotalamice receptive la leptină, precum și expresiei ridicate în mod vizibil a SOCS3 hipotalamic, un regulator negativ cheie al leptinei semnalizare. Astfel, aceste rezultate demască roluri binare distincte pentru semnalizarea mediată de Try 985 în metabolismul energetic, acționând ca un comutator de reglementare dependent de vârstă/dietă pentru a contracara obezitatea asociată vârstei sau indusă de dietă.

Pentru a obține o perspectivă suplimentară asupra rolurilor fosforilării intracelulare a tirozinei Ob-Rb în medierea funcțiilor fiziologice ale leptinei in vivo, am generat anterior două linii de șoareci care exprimă receptori mutanți de leptină cu substituție fenilalanină pentru toate cele trei tirozine sau doar pentru Tyr 1138, dezvăluind contribuția metabolică atât a acțiunilor dependente de tirozină, cât și a acțiunilor independente în homeostazia energetică (26). Aici am investigat consecințele fiziologice ale semnalării abrogării prin Ob-Rb Tyr 985 prin caracterizarea șoarecilor knock-in generați prin introducerea unei mutații de substituție a fenilalaninei la acest sit. Am examinat impactul deficienței în semnalizarea mediată de Tyr 985 asupra susceptibilității șoarecilor la dezechilibrul energetic asociat vârstei și indus de dietă, încercând să explorăm potențialele legături mecanistice dintre rezistența la leptină și influențele mediului, precum îmbătrânirea și supranutriția.

MATERIALE ȘI METODE

Generație de șoareci Y985F knock-in. Strategia de direcționare a genei pentru generarea șoarecilor knock-in (Y985F) care exprimă receptorul mutant al leptinei Ob-Rb F985 a fost efectuată la Centrul de Tehnologie Transgenică din UTSW așa cum s-a descris anterior în detaliu (26). Pe scurt, vectorul de țintire a fost construit prin introducerea Lox-Neo-Lox (LNL), gena de rezistență la neomicină flancată în lox, în aval de exonul mutant 18 al genei Ob-Rb, care conține mutația de substituție țintită la Tyr 985 (Fig. 1A). Clone recombinante stabile omoloage au fost selectate cu G418 din celule stem embrionare 129/Sv (ES) transfectate cu constructul de ADN țintit, urmată de confirmarea substituției Tyr-la-Phe prin analiza secvențială a fragmentelor de ADN de exon amplificat cu PCR 18 . Blastocistii injectați cu clonele ES confirmate au fost ulterior transferate la femele pseudopregnant pentru a produce șoareci agerici himerici, iar direcționarea genică cu succes a fost confirmată în continuare prin Southern blot. Șoarecii knock-in transmiși cu linia germinală au fost încrucișați cu șoareci protamin-Cre, îndepărtând caseta de selecție LNL doar din linia germinativă masculină.

Analiza fenotipică. Grăsimea corporală totală a fost măsurată prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) utilizând un analizor Minispec Mq7.5 (Bruker, Germania). Consumul de alimente a fost determinat de la șoareci cuști individual, cântărind zilnic mâncarea înainte de ciclul de întuneric timp de 5 până la 10 zile. Rapid (6 ore de post, 8:30 a.m. până la 2:30 p.m.) s-a colectat sânge din vena cozii, iar glucoza a fost măsurată folosind un glucometru (FreeStyle, Alameda, CA). Nivelurile de insulină și leptină au fost analizate cu serul de șoarece Adipokine LINCOplex Kit (Linco Research, St. Charles, MO) utilizând sistemul Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, California) conform instrucțiunilor producătorului.

Rata metabolică și activitatea fizică. Consumul de oxigen și activitatea fizică au fost determinate pentru animalele hrănite ad libitum utilizând sistemul cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH) conform instrucțiunilor producătorului. Șoarecii au fost lăsați să se acomodeze cu sistemul timp de 16 până la 20 de ore, iar absorbția de oxigen (VO2) a fost măsurată pentru următoarele 24 de ore. Activitatea voluntară a fost monitorizată din pauzele fasciculului axei x colectate la fiecare 15 minute.

Test de sensibilitate la leptină in vivo. Șoarecii masculi la vârsta de 7 sau 40 de săptămâni au fost injectați intraperitoneal (ip) de două ori pe zi (la 8:30 și 18:00) cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau leptină recombinantă de șoarece (National Hormone and Peptide Program, UCLA, Torrance, CA) (1 mg/kg/zi pentru șoareci de 7 săptămâni și 2,5 mg/kg/zi pentru șoareci de 40 de săptămâni). Șoarecii au fost mai întâi injectați cu PBS timp de 3 zile, urmat de injecție cu leptină timp de 3 până la 4 zile după cum s-a indicat și apoi injecție cu PBS pentru alte 2 zile. Greutatea corporală și consumul de alimente au fost monitorizate zilnic în timpul tratamentului.