O rețea paracrină TRAIL-TL1A care implică adipocite, macrofage și limfocite induce adipos

N.M. și T.P. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Abstract

Introducere

Obezitatea, definită ca acumulare anormală sau excesivă de grăsime care prezintă un risc pentru sănătate, a fost recunoscută ca o boală de către Asociația Medicală Americană în 2013 (1). Cu toate acestea, odată cu creșterea prevalenței sale globale, obezitatea este foarte eterogenă în ceea ce privește gradul de riscuri pe care le impune pentru sănătate și se prezintă diferit chiar și la pacienții cu IMC crescut în mod similar. Odată cu căutarea din ce în ce mai mare a asistenței medicale personalizate, este urgent să se subtipeze mai bine obezitatea (2). În comparație cu persoanele cu obezitate cardiometabolică benignă (denumită probabil „obezitate sănătoasă/sensibilă la insulină/obezitate metabolică normală”), la persoanele cu „obezitate cu risc ridicat cardiometabolic” țesuturile adipoase diferă prin distribuție, morfologie, compoziție celulară, modele moleculare și funcție ( 3). Descoperirile inițiale indică faptul că astfel de diferențe, în special morfologice (dimensiunea adipocitelor, fibroză), pot fi de ajutor în subfenotiparea obezității, nu numai în analizele transversale, ci și în predicția răspunsului clinic la intervențiile obezității (4). Cu toate acestea, amprentarea moleculară a țesutului adipos care ar putea servi pentru o mai bună stratificare, prioritizare sau chiar personalizare a îngrijirii clinice lipsește în mare măsură.

În concordanță cu această noțiune, am constatat că proteinele TVA E2F1 și nivelurile de ARNm corelate cu indicatori clinici multipli ai riscului cardiometabolic ridicat, efect mediat de legarea directă a E2F1 la regiunile promotor ale genelor ASK1 și autofagie (5,6). Cu toate acestea, analizele multivariate care s-au ajustat pentru activarea acestor gene putoare efectoare ale E2F1 au sugerat că căi suplimentare mediază legătura dintre creșterea TVA E2F1 și disfuncția metabolică (5,6). În acest studiu, am folosit analize transcriptomice imparțiale ale E2F1 ridicat față de E2F1 TVA uman scăzut (hVAT) pentru a delimita astfel de căi posibile. Am urmărit membrii superfamiliei factorului de necroză tumorală asociată E2F1 (TNFSF) pe care această analiză le-a dezvăluit și am descoperit o rețea paracrină intercelulară complicată în țesutul adipos, care implică adipocite, macrofage și celule T, care leagă expresia E2F1 a TVA ridicată cu disfuncția țesutului adipos.

Proiectare și metode de cercetare

Cohorte umane și eșantioane de TVA

Participanții au fost din Beer-Sheva, Israel (n = 123) și Leipzig, Germania (n = 421), cohorte (Tabelul 1) cu utilizarea unor proceduri coordonate așa cum s-a descris anterior (5). Pe scurt, după aprobarea de către comitetele de etică ale celor două centre și obținerea consimțământului informat scris, participanții (18-75 ani) au fost recrutați înainte de a fi supuși intervențiilor chirurgicale abdominale elective (proceduri bariatrice sau alte proceduri elective). După post peste noapte, probele de sânge au fost extrase și analizate de laboratoarele clinice de biochimie și endocrinologie. Biopsiile de țesut adipos visceral (omental) au fost obținute în timpul intervenției chirurgicale și livrate imediat la laborator, unde au fost prelucrate pentru expresia ARNm sau proteine folosind proceduri coordonate, așa cum s-a descris anterior (5). Pentru obținerea explanților de țesut adipos uman, probele de țesut au fost tăiate cu atenție și cultivate în MEM-Alpha conținând 4,5 mmol/L glucoză, 10% FBS, 2 mmol/L l-glutamină și 100 unități/ml penicilină-streptomicină pentru recuperare de 24 de ore. Human TRAIL (hTRAIL) (375-TEC-010; D&R Systems) 25 sau 100 ng/ml a fost adăugat la medii proaspete fără ser pentru tratament de 24 de ore. Fracțiile adipocitare și vasculare stromale (SVF) au fost preparate prin digestie colagenază (C6885-5G; Sigma-Aldrich) așa cum s-a descris anterior (15).

Caracteristicile clinice ale participanților din cohorta Leipzig și Beer-Sheva

Culturi celulare

Analiza țesuturilor și celulelor și analiza Western Blot

Pregătirea lizatelor tisulare/celulare și a anticorpilor utilizați a fost descrisă anterior (6). Pentru determinarea proteinelor E2F1, am folosit anti-E2F1 monoclonal Ab by GeneTex (GTX-70154; GeneTex, Irvine, CA).

Extracția ARN, PCR cantitativă în timp real și analiza secvențierii ARN

Alte teste

Nivelurile de leptină și adiponectină în mediul condiționat de Chub-S7 și în serul uman au fost măsurate ca anterior (6). Eliberarea lactatului dehidrogenază (LDH) din adipocitele Chub-S7 a fost măsurată utilizând setul de testare a activității lactatului dehidrogenază (MAK066-1KT; Sigma-Aldrich). LDH eliberat a fost calculat ca procent din total (mediu/mediu + celule). Secreția hTRAIL la mediul condiționat a fost măsurată folosind TRAIL ELISA imunoquantitativ (RayBio). Lipoliza a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (22), cu adenozin deaminază (ADA) la 1 µU/mL și efectul antilipolitic al insulinei după 24 ore de foamete de insulină.

Acumularea de lipide macrofage

MDM au fost diferențiate așa cum este descris în plăci cu 96 de godeuri μClear, negre (Greiner-Bio One). M0 MDM au fost tratați cu control sau TL1A 25 ng/ml mediu fără ser timp de 24 de ore. Acumularea de lipide în condiții îmbogățite cu acizi grași s-a făcut prin adăugarea a 10 mmol/L acid oleic pentru incubarea finală de 2 ore, după cum s-a descris anterior (23). Celulele au fost fixate cu 4% formaldehidă urmată de colorare cu BODIPY 493/503 (1 μg/mL) (D3922; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și DAPI (5 ng/mL) (62248; Thermo Fisher Scientific) timp de 20 de minute la temperatura camerei și apoi spălat cu PBS suplimentat cu Ca +2/Mg +2 (02-020-1A; Biological Industries). Imaginile au fost achiziționate într-o manieră complet automată, imparțială, folosind un microscop echipat cu lentile cu unghi larg × 40 (Operetta; PerkinElmer, Waltham, MA). Analiza statistică a fost făcută utilizând software-ul Columbus (PerkinElmer).