O reducere a raportului M1-likeM2-like de macrofage în expansiunea țesutului adipos sănătos în timpul SGLT2

Subiecte

Abstract

Introducere

Obezitatea a devenit una dintre preocupările majore de sănătate publică din ultimele decenii, fiind un factor cheie de risc pentru diabetul de tip 2, bolile cardiovasculare, dislipidemia, hipertensiunea și anumite tipuri de cancer, ducând astfel la o mortalitate crescută. În timp ce tratamentul pentru obezitate și prevenirea bolilor legate de obezitate nu au întotdeauna succes, un subgrup de indivizi obezi prezintă un risc scăzut de complicații metabolice. „Obezitatea sănătoasă din punct de vedere metabolic (MHO)” reprezintă un astfel de subgrup de indivizi obezi care prezintă acumularea excesivă de țesut adipos fără efecte metabolice adverse, inclusiv rezistența la insulină, intoleranța la glucoză și dislipidemia 1. Persoanele MHO se caracterizează prin creșterea capacității de depozitare a grăsimii țesutului adipos cu fenotip antiinflamator și scăderea depunerii de grăsime ectopică în ficat și mușchiul scheletic; aceste modificări morfologice și funcționale ale țesutului adipos inhibă în consecință dezvoltarea rezistenței la insulină și a bolilor cardiometabolice.

Inhibitorii cotransportorului de sodiu-glucoză 2 (SGLT2) sunt medicamente antidiabetice orale care promovează excreția urinară a glucozei prin blocarea reabsorbției acesteia în tubulii proximali renali. Am raportat anterior că inhibitorul SGLT2 ipragliflozin (Ipra) promovează expansiunea țesutului adipos epididimal (Epi) fără a deteriora metabolismul sistemic al glucozei/lipidelor și inflamația adipoasă la șoarecii obezi 2,3. Această stare de creștere a masei grase cu o capacitate metabolică conservată a fost denumită „expansiune sănătoasă a țesutului adipos”, care este similară cu țesutul adipos găsit la indivizii MHO.

În acest studiu, am demonstrat că Ipra a promovat expansiunea țesutului adipos sănătos asociat cu un raport redus de tip M1/M2 de tip ATM-uri. Observația noastră a sugerat că modificarea raportului asemănător M1/M2 al ATM-urilor ar putea determina adipocitele să inducă expansiunea sănătoasă a țesutului adipos în timpul inhibării SGLT2 și, mai larg, ar putea oferi noi perspective asupra mecanismelor de expansiune adipoasă care ar putea fi ținte terapeutice. pentru comorbiditățile metabolice asociate obezității.

Materiale și metode

Experimente pe animale

Analiza metabolică

Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru (Glutest Pro R). Concentrațiile serice de insulină și acid gras (FFA) au fost măsurate utilizând testul imunosorbent legat de enzime (Morinaga, Yokohama, Japonia) și metoda enzimatică (Wako, Osaka, Japonia), respectiv. Nivelurile de hidroxibutirat beta (BHB) au fost determinate folosind o metodă colorimetrică (ab83390, Abcam). Concentrațiile serice de colesterol total, trigliceride (TG) și alanină aminotransferază (ALT) au fost măsurate folosind Fuji Dry-chem 7000 V (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japonia). Pentru testele de toleranță la glucoză (GTT), șoarecii au fost posti timp de 16 ore cu acces gratuit la apă, urmat de injecția intraperitoneală de glucoză (2 g/kg). Am măsurat concentrațiile de glucoză din sânge la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute după injectare. Concentrația mare de glucoză nemăsurată (> 600 mg/dl) a fost înregistrată la 600 mg/dl. Toate analizele, cu excepția GTT, au fost efectuate în stare alimentată ad libitum.

Histologie

Țesutul adipos a fost fixat în soluție tampon de fosfat de paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore la temperatura camerei. Secțiunile deparafinizate (2 μm) au fost incubate cu proteinază K timp de 5 min pentru antigenul de recuperare. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost blocată cu 0,3% H2O2 în metanol timp de 30 de minute. Un anticorp anti-șobolan F4/80 (clonă: A3-1, diluție 1: 1000: AbD Serotec) și un anticorp IL-15 anti-policlonal de iepure (1 µg/ml, PeproTech) au fost utilizate pentru a evalua infiltrarea macrofagelor și pentru a detectează celule care exprimă IL -15 în țesutul adipos, respectiv. Numărul de structuri asemănătoare coroanei a fost numărat în 15 câmpuri diferite (× 200) per diapozitiv și exprimat ca număr mediu pe câmp. Zona pozitivă IL-15 a fost măsurată în 15-18 câmpuri diferite (× 200) per diapozitiv folosind imaginea J. Dimensiunea adipocitelor a fost cuantificată cu programul Fiji (imaginea J) Adiposoft 1.13 așa cum a fost descris anterior 3 .

Cultură de celule

Celulele 3T3-L1 au fost achiziționate de la ATCC și menținute în mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM) conținând 10% ser de vițel. La două zile după atingerea confluenței de 100%, celulele au fost incubate în DMEM conținând 10% ser bovin fetal (FBS), 5 µg/ml insulină, 0,5 mM izobutilmetil xantină și 0,25 µM dexametazonă (ziua 0). După 2 zile, mediul a fost înlocuit cu DMEM conținând 10% FBS și 5 μg/ml insulină (ziua 2). Ulterior, mediul de cultură a fost înlocuit la fiecare 2 zile cu DMEM conținând 10% FBS. Adipocitele diferențiate au fost stimulate cu IL-15 murin recombinant (50 sau 250 ng/ml, Peprotech) în zilele 10, 12 și 14, așa cum s-a descris anterior 14 cu unele modificări. În ziua 15 de diferențiere, celulele au fost fixate cu soluție tampon de paraformaldehidă fosfat 4% timp de 2 ore la temperatura camerei și spălate cu izopropanol 60% timp de 1 min. Celulele fixe au fost colorate cu soluție filtrată de ulei roșu O timp de 2 ore la temperatura camerei. Pentru a cuantifica conținutul de lipide, Oil Red O a fost eluat cu izopropanol 100% și absorbanța extractelor a fost măsurată la 540 nm folosind un cititor de microplăci (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA).

Pentru izolarea macrofagelor peritoneale, șoarecii masculi WT de 12 săptămâni au fost injectați intraperitoneal cu 3% tioglicolat Brewer. Patru zile mai târziu, macrofagele au fost colectate prin spălare peritoneală utilizând DMEM rece conținând 2% FBS. Celulele au fost cultivate timp de 3 ore în DMEM conținând 0,25% albumină serică bovină (BSA) și 1% penicilină/streptomicină. Culturile au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) pentru a îndepărta celulele neaderente, pretratate cu BHB (1 sau 10 mM) în mediu de cultură și stimulate cu lipopolizaharidă (LPS, 1 ng/ml), IL-4 (10 ng/ml) )., Biolegend) sau IL-13 (10 ng/ml, Biolegend) peste noapte.

Izolarea adipocitelor și a celulelor fracției vasculare stromale

Epi a fost cântărit, tocat și digerat în 15 ml soluție de colagenază tip 2 (2 mg/ml, Worthington) timp de 20 minute la 37 ° C cu agitare ușoară. Amestecul de digestie a fost centrifugat la 500 g timp de 3 min. Adipocitele plutitoare au fost colectate pentru extracția acidului ribonucleic (ARN) și peletele care conțin celule ale fracției vasculare stromale (SVF) au fost suspendate în PBS. Suspensia a fost trecută printr-un filtru de plasă de nailon de 100 μm (BD Falcon) și centrifugată la 500 g timp de 3 min pentru a granula celule SVF.

Izolarea leucocitelor din sângele periferic

Probele de sânge au fost obținute din vena cozii folosind tuburi capilare. Sângele a fost amestecat cu acid etilendiaminetetraacetic 0,5 M (EDTA), lizat cu tampon de lizare ACK și centrifugat la 500 g timp de 3 min.

Citometrie de flux și sortare celulară

Celulele SVF izolate sau leucocitele au fost resuspendate în 200 μl PBS conținând 0,25% BSA, 0,2 mM EDTA și 1% penicilină/streptomicină. Celulele au fost preincubate timp de 7 minute la 4 ° C în bloc Fc (CD16/32, BD Biosciences) și apoi colorate timp de 15 minute cu anticorpi conjugați cu fluorofor la 4 ° C. Au fost utilizați următorii anticorpi: anti-CD45 (clonă: 30-F11, Biolegend), anti-F4/80 (clonă: BM8, Biolegend), anti-CD11b (clonă: M1/70, Biolegend), anti-CD11c: N418, Biolegend), anti-CD206 (clonă: C068C2, Biolegend), anti-CCR2 (clonă: SA203G11, Biolegend), anti-Ly6G/Ly6C (clonă: RB6- 8C5, Biolegend) și anti-CD115 (clonă: AFS98, Biolegend) 15. Analiza citometrică de flux a fost efectuată folosind un FACSCantoII (BD Biosciences). Sortarea celulelor a fost efectuată cu un FACSAriaII (BD Biosciences). Datele au fost analizate utilizând software-ul FlowJo (v9.4.10, Tree Star).