O metodă simplă pentru a determina evaporarea și a compensa pierderile de lichid într-o celulă la scară mică
Vincent Wiegmann
1 Centrul Avansat pentru Inginerie Biochimică, Departamentul de Inginerie Biochimică, University College London, Torrington Place, Londra, WC1E 7JE UK
Cristina Bernal Martinez
2 Applikon-Biotechnology BV, Heertjeslaan 2, 2629 JG Delft, Olanda
Frank Baganz
1 Centrul Avansat de Inginerie Biochimică, Departamentul de Inginerie Biochimică, University College London, Torrington Place, Londra, WC1E 7JE UK
Abstract
Obiective
Stabilirea unei metode pentru măsurarea indirectă a evaporării în sistemele de cultură celulară bazate pe microgodeuri și arătarea faptului că metoda propusă permite compensarea pierderilor de lichid în procesele alimentate în loturi.
Rezultate
S-a găsit o corelație între evaporare și concentrația de Na + (R 2 = 0,95) la utilizarea sistemului bioreactor miniatural cu 24 de godeuri (micro-Matrix) pentru o cultură discontinuă cu GS-CHO. Pe baza acestor rezultate, a fost dezvoltată o metodă de combatere a evaporării cu adăugări periodice de apă pe baza măsurătorilor concentrației de Na +. Implementarea acestei metode a dus la o reducere a pierderii relative de lichid după 15 zile de cultivare pe loturi alimentate de la 36,7 ± 6,7% fără corecții de volum la 6,9 ± 6,5% cu corecții de volum.
Concluzie
A fost stabilită o procedură pentru măsurarea indirectă a evaporării printr-o corelație cu nivelul ionilor de Na + în soluție și derivând o formulă simplă pentru a ține cont de pierderile lichide.
Introducere
Procesele biotehnologice se desfășoară în mod obișnuit la temperaturi ridicate și, ca rezultat, aerul din sistem are de obicei umiditate ridicată, ceea ce poate duce la un conținut ridicat de lichid în gazele reziduale. Pe măsură ce vaporii părăsesc sistemul prin conducta de evacuare a gazelor, volumul de umplere al vasului de cultivare va scădea treptat. Nu numai că condițiile de operare sunt direct afectate de aceste modificări de volum, evaporarea poate afecta negativ procesul prin efecte de concentrare și presiuni osmotice ridicate care duc la limitări ale creșterii celulare (Silk et al. 2010; Bareither și Pollard 2011; Lattermann și Büchs 2016 ).
Deși închiderea puțurilor reduce evaporarea, inconsecvențele ratelor de evaporare rămân o problemă pentru sistemele aerate activ, cum ar fi microbioreactoarele, în special, unde presiunile de gaz inegale duc la discrepanțe ale ratelor de evaporare (Chen și colab. 2009). În aceste sisteme, ratele de evaporare sunt guvernate de debitele de gaz, care la rândul lor pot fi afectate de condițiile de cultură. Mai ales în experimentele de cultură celulară pe termen lung, devine necesar să se compenseze lichidul evaporat prin adăugări periodice de apă distilată sterilă pentru a asigura condiții consistente pe tot parcursul experimentului. În formatele pe bază de plăci de microtitrare, evaporarea pe godeu este de obicei dedusă din pierderea totală în greutate a plăcii (Betts et al. 2014). Cu toate acestea, această metodă presupune că rata de evaporare este aceeași în toate puțurile, ceea ce poate duce la volume de lucru și condiții de cultură foarte variabile. Măsurarea efectului de concentrare a uneia sau mai multor componente media poate fi utilizată ca o alternativă viabilă, mai puțin invazivă și ușor de realizat alături de analiza eșantionului.
Această lucrare evaluează adecvarea a trei potențiali electroliți pentru utilizare ca markeri de evaporare și propune o metodă ieftină pentru a măsura indirect evaporarea în compartimente de cultură celulară la scară mică. Această nouă metodă este demonstrată ca parte a unui experiment exemplar alimentat în loturi cu celule CHO crescute în microbioreactorul micro-Matrix.
Materiale și metode
Pre-cultura
Flacoanele unei linii celulare GS-CHO care exprimă IgG (Lonza, Marea Britanie) au fost decongelate și diluate cu 49 ml de CD-CHO încălzit (Life-Technologies, Marea Britanie) conținând 25 μM MSX. Celulele au fost apoi extinse timp de 7 zile într-un balon de agitare cu capac de aerisire (250 ml volum nominal, Corning Life Sciences, SUA) montat pe un agitator orbital (Sartorius, Marea Britanie) la 37 ° C, 5% CO2 și 70% umiditate.
micro-Matrix
Micro-Matrix (Applikon-Biotechnology BV, Olanda) este o platformă de micro-bioreactoare care permite 24 de culturi paralele cu control individual al pH-ului, oxigenului dizolvat (DO) și temperaturii. Cultivările se efectuează într-o casetă cu 24 de godeuri de unică folosință, cu un volum optim de lucru între 2 și 5 ml.
procedura de cultură celulară micro-matricială
Valorile de compensare pentru calibrarea sondei de pH au fost determinate prin umplerea fiecărei godeuri a casetei micro-Matrix cu 2 mL 1 × PBS (Life-Technologies, UK) și montarea casetei pe sistemul micro-Matrix. Sondele au fost apoi lăsate pentru echilibrare, fără nici o scuturare sau adăugare suplimentară de gaze. După 1 oră, 1 ml a fost extras din fiecare godeu și măsurat pentru pH cu un pH-metru offline (Mettler Toledo, Elveția). Valorile de compensare au fost apoi ajustate astfel încât măsurătorile online să corespundă valorilor offline.
O suspensie cu o concentrație finală de 3 × 105 celule viabile ml -1 a fost preparată utilizând cantitatea adecvată de mediu CD-CHO. 3,5 ml din această suspensie au fost umplute în fiecare godeu al casetei cu godeuri pătrate de 24 de adâncimi (Applikon, Olanda). Caseta micro-Matrix a fost acoperită cu placa superioară, conectată la liniile de alimentare cu gaz și apoi fixată pe modulul termic optic (OTM) al micro-Matrix. Punctele stabilite au fost specificate la pH 7,2, 30% DO și 37 ° C. Controlul scăzut al pH-ului a fost realizat prin adăugarea de CO2; DO a fost controlat prin adăugarea de O2 și N2. Viteza de agitare a fost setată fie la 220, fie la 250 rpm. PH-ul și DO au fost măsurate ambele la intervale de 10 s folosind senzori optici amplasați în partea de jos a fiecărei godeuri. Temperatura godeului a fost controlată pentru fiecare godeu cu elemente Peltier situate, de asemenea, în partea de jos a fiecărei godeuri.
Protocol Fed-batch
Hrănirea a început în ziua a 3-a a cultivării și apoi a fost repetată la fiecare două zile. Adăugările în bolus ale Efficient Feed B (Life-Technologies, UK) au fost setate la 10% v/v din volumul inițial de lucru. În plus, suspensia celulară a fost înțepenită cu tampon de bicarbonat (250 mM Na2HCO3 și 250 mM NaH2CO3) stabilit la 2,5% v/v din volumul inițial de lucru în zilele 2, 4 și 5 pentru a ajusta pH-ul în sus în perioada de lactat ridicat. formare.
Eșantionare și analiză
Pentru cultura discontinuă, trei godeuri au fost sacrificate în fiecare zi de probă. Suspensia celulară din interiorul acestor godeuri a fost complet îndepărtată și cântărită pentru a determina pierderea de volum datorată evaporării. Toți parametrii dependenți de volum au fost corectați pentru pierderea volumului. În cazul culturii alimentate în loturi, volumele de eșantioane cuprinse între 350 și 500 μL au fost preluate din fiecare godeu la prelevare. Volumul exact depinde de analizele care se efectuează într-o anumită zi (Tabelul 1). Concentrația celulară a fost determinată utilizând Vi-CELL XR (Beckman Coulter, Marea Britanie) și suspensia celulară rămasă a fost centrifugată la 1000 × g timp de 5 minute. Analizorul FLEX Bioprofile (Nova Biomedical, SUA) a fost utilizat pentru a determina nivelurile tuturor nutrienților, metaboliților și electroliților relevanți. Cuantificarea IgG4 a fost efectuată utilizând o cromatografie lichidă (HPLC) de înaltă performanță Agilent 1200 (Agilent Technologies, Marea Britanie) cu o coloană 1 mL HiTrap Protein G HP (GE Healthcare, Marea Britanie).