Indicele de masă corporală scăzut în endometrioză este promovat de disregularea genei metabolice hepatice la șoareci
Laura G. Goetz
Departamentul de Obstetrică, Ginecologie și Științe ale Reproducerii, Școala de Medicină Yale, New Haven, Connecticut
Ramanaiah Mamillapalli
Departamentul de obstetrică, ginecologie și științe ale reproducerii, Școala de medicină Yale, New Haven, Connecticut
Hugh S. Taylor
Departamentul de Obstetrică, Ginecologie și Științe ale Reproducerii, Școala de Medicină Yale, New Haven, Connecticut
Abstract
INTRODUCERE
Endometrioza este una dintre cele mai frecvente tulburări ginecologice la femeile în vârstă de reproducere [1]. Se caracterizează prin depunerea și proliferarea celulelor endometriale sau a țesutului în afara cavității uterine [2, 3]. Simptomul major al endometriozei este durerea pelviană, care afectează 50% dintre pacienți [4], urmată de infertilitate, care este raportată la 40% -50% dintre pacienți [5]. Aceste simptome pot afecta grav calitatea vieții unei femei [6] ]. Endometrioza este o tulburare variată și complexă, pacienții raportând adesea simptome difuze care nu au legătură cu reproducerea, iar cauza precisă și fiziopatologia nu sunt încă bine înțelese [1, 7]. Femeile cu boală se plâng adesea de pierderea în greutate, alergii, oboseală, inflamație și disfuncție intestinală.
Cauza acestor simptome inexplicabile anterior nu este cunoscută, dar poate proveni din dereglarea mai multor căi moleculare în mai multe sisteme de organe din afara tractului reproductiv. Existența unui indice de masă corporală mai scăzut (IMC) la femeile cu endometrioză comparativ cu cele fără boală este bine stabilită [8-15]. Niciun studiu anterior nu a investigat efectele endometriozei asupra ficatului. În prezent nu se știe dacă fenotipul IMC scăzut observat la femeile cu endometrioză este direct atribuibil bolii și, dacă da, prin ce mecanism. Aici am căutat să determinăm dacă endometrioza ar putea provoca dereglare metabolică.
Ficatul este un punct major al reglării metabolice și un mediator central pentru menținerea homeostaziei energetice [4, 16-19]. Expresia genei ficatului s-a dovedit a fi perturbată în mod specific la femeile cu obezitate [20-22]. Endometrioza creează un mediu inflamator modificat [23-25] care ar putea modifica expresia genelor în organele îndepărtate. Într-adevăr, am demonstrat anterior că endometrioza afectează expresia genelor uterine [26], sugerând că endometrioza poate duce la modificarea expresiei genelor și în organele neproductive. Modificări ale expresiei genelor hepatice datorate endometriozei nu au fost încă raportate; cu toate acestea, s-a demonstrat că dereglarea genei hepatice modifică IMC la un model de șoarece [27], iar obezitatea a fost asociată clinic cu modificarea expresiei genice în ficat [28, 29]. Acest lucru face din ficat un candidat interesant pentru implicarea într-o posibilă componentă metabolică a endometriozei.
Aici am comparat greutatea corporală, compoziția corporală și expresia genelor hepatice la șoareci cu endometrioză indusă chirurgical cu cele ale șoarecilor de control care au fost supuși unei intervenții chirurgicale simulate. Am identificat întreruperea metabolică indusă de endometrioză asociată cu greutatea corporală redusă și grăsimea. Aceste descoperiri pot explica greutatea corporală scăzută observată clinic la femeile cu endometrioză.
MATERIALE ȘI METODE
Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu o aprobare din protocolul Comitetului de îngrijire a animalelor de la Universitatea Yale, utilizând un total de 30 de șoareci. Endometrioza a fost indusă la șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 12 săptămâni (n = 6) prin suturarea a două secțiuni uterine, fiecare constând dintr-o jumătate de corn uterin de la un donator, în cavitatea peritoneală conform tehnicilor raportate anterior [30, 31 ]. Au fost efectuate intervenții chirurgicale la șoareci martor (n = 6). Mâncarea a fost consumată ad libitum de toate animalele și ambele grupuri au primit același chow. Șoarecii au fost cântăriți săptămânal pe o cântare portabilă (Uline), iar greutățile corporale au fost înregistrate la cel mai apropiat 0,1 de gram, începând cu 1 săptămână după operația de inducție. Absorptiometria cu raze X cu energie duală (DEXA; GE Medical Systems) a fost efectuată la 7 săptămâni după operație. Într-un alt set de șoareci femele C57BL/6 de 9 săptămâni, endometrioza a fost indusă în conformitate cu aceleași proceduri chirurgicale (n = 9 în fiecare grup). Acest set de șoareci a fost eutanasiat prin dislocare cervicală după asfixierea CO2 la 21 săptămâni, iar ficatul a fost colectat și depozitat în ARNlater (Qiagen) la -80 ° C pentru izolarea ARN și proteine. Prezența leziunilor persistente de endometrioză a fost confirmată la necropsie.
Izolarea ARN-ului
Țesutul hepatic (100 mg) a fost omogenizat în 1 ml de reactiv TRIzol (Invitrogen). Omogenatele au fost ținute pe gheață timp de 5 minute, apoi s-au adăugat 0,2 ml de cloroform la fiecare și probele au fost agitate timp de 15 secunde, incubate la temperatura camerei timp de 3 minute și centrifugate la 12.000 rpm la 4 ° C timp de 15 minute. Apoi, stratul apos a fost transferat într-un tub proaspăt și ARN-ul a fost precipitat prin adăugarea a 0,5 ml alcool izopropilic, incubat la temperatura camerei timp de 10 min și centrifugat la 10.000 rpm timp de 15 min; apoi peletele de ARN au fost colectate, spălate cu 75% etanol și dizolvate în apă fără RNază. ARN-ul total a fost purificat folosind trusa de curățare RNeasy (Qiagen) și cuantificat printr-un spectrofotometru NanoDrop. ARN-ul purificat a fost imediat utilizat pentru sinteza ADNc și apoi supus analizei microarray sau stocat la -80 ° C până când a fost utilizat mai târziu.
Mouse Gene Microarray
ARN total de înaltă calitate (250 ng) a fost supus kitului de reactivi WT PLUS (Affymetrix) urmând instrucțiunile producătorului. Pe scurt, ARN-ul total a fost amplificat pentru a crea ADNc care a fost utilizat pentru transcrierea in vitro pentru a crea ARN complementar (ARNc). ARNc a fost curățat folosind purificarea mărgelelor și cuantificat. ARNc (15 μg) a fost utilizat cu un primer aleatoriu pentru a genera un al doilea ciclu de ADNc de direcție senzorială pe prima catenă. ADNc a fost purificat utilizând metoda de curățare a mărgelei și cuantificat. ADNc monocatenar (sscDNA; 5,5 μg) a fost apoi fragmentat enzimatic folosind ADP și UDG, folosind un kit de etichetare terminal (Affymetrix) și rulat pe un bioanalizator (Agilent) pentru a asigura dimensiunea corectă a transcriptului. Materialul fragmentat a fost marcat ulterior folosind deoxinucleotidil transferaza terminală, plasat într-un cocktail de hibridizare și hibridizat folosind matrice GeneChip de șoarece 2.0 ST peste noapte la 45 ° C. Tablourile au fost spălate și colorate folosind stația fluidică model 450 și apoi scanate folosind scanerul model 3000 7G (ambele Affymetrix). Software-ul consolei de expresie Affymetrix a fost utilizat pentru a genera date brute și normalizate pentru analiza din aval. MATLAB (MathWorks) a fost folosit pentru a analiza ieșirea datelor.