Identificarea locurilor genetice asociate cu răspunsuri diferite la obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

Institutul de Biochimie, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Junior Research Group 2 „Modele animale de obezitate”, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania; și

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Junior Research Group 2 „Modele animale de obezitate”, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania; și

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: N. Klöting, Dept. de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania (e-mail: [email protected]).

Abstract

O diferență genetică studiată pe scară largă între șoarecii C57BL/6J și C57BL/6N a fost găsită în nucleotida transhidrogenază a nicotinamidei (Nnt) genă pe cromozomul 13. În tulpina C57BL/6J, o mutație missense (metionină la treonină), în combinație cu mutația de deleție a exonului în cadrul 5 (eliminarea a patru elici transmembranare putative), are ca rezultat o variantă Nnt trunchiată și semnificativ mai mică Expresia proteinei Nnt în ficat și insule (14, 46). Activitatea Nnt a fost legată de alterarea metabolismului glucozei și secreția de insulină (13, 46).

Genotiparea recentă a polimorfismelor cu nucleotide unice (SNPs) a identificat diferențe genetice suplimentare între substanțele C57BL/6J și C57BL/6N la 11 loci (24, 31, 51). Un SNP a fost găsit între substrenele C57BL/6J, în timp ce nu s-au detectat diferențe genetice între substrenele C57BL/6N (31, 51). Cinci din cele 11 loci map în cadrul genelor cunoscute. Genotipul factorului de creștere a fibroblastelor 14 (Fgf14), LIM și domenii asemănătoare antigenului celulelor senescente 1 (Lims1), proteina 2 asemănătoare unui precursor amiloid (Aplp2) și proteina solubilă de atașament a factorului n-etilmaleimidă 29 (Snap29) diferă între tulpinile C57BL/6N și C57BL/6J și un SNP asociat cu dipeptidază acidă asemănătoare 2 cu N-acetilată cu dipeptidază acidă (Naaladl2) între anumite substrene C57BL/6J.

Studiile asupra obezității induse de dietă bogată în grăsimi (HFD) au relevat diferențe între substrainele de bază C57BL/6NTac și C57BL/6JRj în ceea ce privește răspunsul lor la un HFD și dezvoltarea DIO (36). Recent, am raportat diferențe fenotipice în condiții HFD între substanțele C57BL/6NTac și C57BL/6JRj și am constatat că tulpina C57BL/6JRj este protejată împotriva DIO independent de activitatea fizică și de aportul alimentar (24).

Pentru a defini diferențele genetice cauzale care pot sta la baza și explica variabilitatea reacției HFD și a manifestării DIO la șoarecii C57BL/6J și C57BL/6N, am caracterizat genetic și fenotipic primii hibrizi backcross (BC1) ai șoarecilor C57BL/6NTac și C57BL/6JRj [( C57BL/6NTac × C57BL/6JRj) F1 × C57BL/6NTac]. În plus, pentru a evalua dacă polimorfismele SNP ar putea afecta nivelurile de ARNm, am efectuat analize de exprimare a genei în timp real pe probe de ficat murin și țesut adipos subcutanat uman.

Animale și fenotipare.

Toate experimentele au fost conforme cu Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicate de Institutele Naționale de Sănătate ale SUA (publicația nr. 85-23, revizuită în 1996) și au fost aprobate de autoritățile locale (Regierungspräsidium Leipzig) din statul Saxonia, Germania, după cum recomandă comitetul local de evaluare a eticii animalelor.

Genotiparea SNP.

ADN-ul a fost extras din vârfurile cozii cu kitul DNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). Genotiparea SNP a fost făcută folosind testul TaqMan SNP Genotyping conform protocolului producătorului (Applied Biosystems, Foster City, CA). Pentru a evalua reproductibilitatea genotipării, am regenotipiat o selecție aleatorie de 5% a eșantionului pentru toate SNP-urile; toate genotipurile s-au potrivit cu genotipurile inițiale desemnate. Mai mult, ADN-ul genomic de la hibrizii F1 și tulpinile parentale au servit drept martori. Ratele de apel pentru toate SNP-urile au variat de la 98 la 100%.

Analiza expresiei.

ARN-ul total a fost izolat din ficat congelat rapid ( = 7 per genotip) și țesut adipos subcutanat = 6 pe genotip) eșantioane folosind kitul RNeasyMini (Qiagen). RT-PCR a fost efectuat cu sistemul TaqMan 7500 (ABI, Darmstadt, Germania). 36B4 a fost folosit ca referință internă. S-au folosit următoarele grunduri: Snap29 5′-AGGCTACAGGATGCAGAACTAGACT-3 ′ (înainte) și 5′-TGTCATCCTGTTCCTCAATTTCT-3 ′ (invers), Aplp2 5′-CCGAATGGACAGGGTAAAGA-3 ′ (înainte) și 5′-CACAAGCTGCTGCTTCTCAC-3 ′ (invers), Lims1 5′-GGAGCTGAAAGGGGAGCTAT-3 ′ (înainte) și 5′-TGCCCAAGAAATGGTTTTTC-3 ′ (invers), Snca 5′-CAGAGGCAGCTGGAAAGACA-3 ′ (înainte) și 5′-CACCACTGCTCCTCCAACAT-3 ′ (invers). Expresia genetică relativă a fost calculată prin metoda curbei standard.

Subiecți umani.

Țesutul adipos subcutanat a fost obținut de la 234 bărbați caucazieni ( = 84) și femei = 150) care au fost supuși unei intervenții chirurgicale abdominale deschise pentru colecistectomie, apendectomie, intervenție chirurgicală de reducere a greutății, leziuni abdominale sau laparotomie explorativă (Tabelul 1). Vârsta a variat de la 18 la 89 de ani și indicele de masă corporală (IMC) de la 14,1 la 71,0 kg/m 2. Șaizeci și nouă de subiecți au avut diabet de tip 2. Toți subiecții au avut o greutate stabilă, fără fluctuații de> 3% din greutatea corporală timp de cel puțin 3 luni înainte de operație. Pacienții cu afecțiuni severe, inclusiv inflamație generalizată sau boli maligne în stadiu final, au fost excluși din studiu. Probele de țesut adipos visceral și subcutanat au fost imediat congelate în azot lichid după explicație. Studiul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Leipzig (Germania). Toți subiecții au dat consimțământul scris în scris înainte de a lua parte la studiu.