Efectul selectiv al fosfatidilcolinei asupra lizei adipocitelor
Ji-Young Kim
1 Departamentul de Științe Biomedice, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, Seoul, Coreea
2 Institutul de Tehnologie Bio-Medicală, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Seul, Coreea
Min-Seo Kwon
1 Departamentul de Științe Biomedice, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, Seoul, Coreea
2 Institutul de Tehnologie Bio-Medicală, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Seul, Coreea
Fiul lui Junghyun
3 Departamentul de chimie biologică, Universitatea de Știință și Tehnologie din Coreea, Daejeon, Coreea
4 Centrul de control al dopajului, Institutul Coreean de Știință și Tehnologie, Seul, Coreea
Sang-Wook Kang
1 Departamentul de Științe Biomedice, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, Seoul, Coreea
Youngsup Song
1 Departamentul de Științe Biomedice, Universitatea din Ulsan, Colegiul de Medicină, Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, Seoul, Coreea
Conceptualizare: YS JK.
Analiza formală: JK YS.
Achiziție de finanțare: YS.
Investigație: JK MK HS.
Metodologie: YS JK SK.
Administrarea proiectului: YS SK.
Resurse: JK MK.
Supraveghere: YS.
Validare: JK MK.
Vizualizare: JK YS.
Scriere - schiță originală: YS JK.
Scriere - recenzie și editare: YS.
Date asociate
Toate datele noastre sunt conținute în hârtie și fișiere de informații de susținere
Abstract
Introducere
Peste 30% din populația SUA suferă de obezitate. Este un factor de risc grav care poate induce sau exacerba multe tulburări metabolice, inclusiv boli cardiovasculare, dislipidemie și diabet. De asemenea, a fost asociat cu probleme de sănătate mintală; există o prevalență crescută a depresiei în rândul pacienților obezi [1], care la rândul său afectează negativ multe aspecte ale vieții și poate duce la afectarea comportamentului social, tulburări alimentare și scăderea stimei de sine [2]. Prin urmare, reducerea țesutului adipos este importantă pentru rezolvarea problemelor medicale, precum și pentru scopuri estetice.
În acest studiu, am utilizat atât metode in vitro, cât și un model de șobolan in vivo pentru a compara activitățile de reducere a grăsimilor din PPC și DC și le-am testat specificitatea adipocitelor.
Materiale și metode
Reactivi
PPC (97,8% polien fosfatidilcolină pură) și sodiu DC (99,1% pur) au fost achiziționate de la Lipoid (Lipoid Kosmetik AG, Elveția) și respectiv NZP (New Zealand Pharmaceuticals, Ltd., Noua Zeelandă). Formula PPC/DC prezentată în Fig 1 conține 5% PPC și 2,4% DC sodiu în apă, iar soluția DC prezentată în Figura conține 2,4% DC sodiu. Pentru tratamentul PPC și DC în preadipocite 3T3L1, adipocite și șobolani, soluții stoc 5% PPC și DC au fost preparate în etanol și, respectiv, în apă.
A. Viabilitatea celulelor 3T3L1 și B. adipocite a fost măsurată la opt ore după tratament cu diferite doze de formulă PPC/DC sau DC numai utilizând testul MTT. Probele de proteine din preadipocite C. 3T3L1 și D. adipocite după 0,01% sau 0,1% formulă PPC/DC sau tratament DC timp de opt ore, respectiv, au fost preparate și analizate prin Western blot.
Animale și design experimental
Analiza RMN
Aproximativ 10 imagini au fost luate pentru a acoperi întreaga zonă a tamponului de grăsime inghinală pentru fiecare animal, înainte de injectare și la 7, 14 și 28 de zile după injectare. După colectarea tuturor imaginilor, a fost efectuată o analiză oarbă pentru măsurarea suprafeței de grăsime inghinală folosind imaginea J cu pragul de intensitate a grăsimii (intensitatea albului) stabilit la 10.000.
Cultura 3T3L1 și diferențierea adipocitelor
Linia celulară 3T3L1 a fost cultivată în mediul esențial minim Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin (HyClone, Logan, UT, SUA) și 1% penicilină-streptomicină. Pentru diferențierea adipocitelor, celulele 3 × 10 5 3T3L1 au fost placate în plăci cu 12 godeuri. La două zile după placare, adipogeneza a fost indusă prin trecerea la un mediu de cultură 3T3L1 suplimentat cu 4 mg/ml dexametazonă, 0,5 μM IBX, 0,5 unitate/ml Humulin (Lilly, SUA) și 100 nM rosiglitazonă (Roche, Elveția). La două zile după expunerea celulelor la mediul de inducție adipogen, acesta a fost înlocuit cu mediu de cultură 3T3L1 proaspăt conținând doar 0,5 unități/ml Humulin și 100 nM rosiglitazonă. Mediul proaspăt a fost adăugat la fiecare două zile pentru alte 5 sau 6 zile. Adipogeneza a fost determinată prin evaluarea microscopică cu lumină a formării vacuolului lipidic și a colorării cu roșu uleios.
Analiza viabilității celulare
Soluțiile stoc PPC sau DC (5%) au fost diluate pentru a obține 1000 × pentru fiecare concentrație și au fost aplicate pe mediul de cultură celulară, astfel încât concentrația finală a solventului (etanol pentru PPC și apă pentru DC) expus celulelor a fost 0,1 %. Viabilitatea celulară a fost evaluată utilizând testul MTT. Pe scurt, cu o zi înainte de experiment, 10 × 104 celule au fost placate în plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri. În ziua experimentului, s-a adăugat PPC, DC sau controlul (etanol ca control PPC și apă ca control DC), așa cum se indică în legendele din figură; cu o oră înainte de încheierea experimentului, s-au aplicat 5 mg/ml MTT (Duchefa Biochemie, Olanda). Celulele au fost spălate cu PBS și s-a aplicat 150 pl DMSO timp de 15 minute pentru a extrage colorantul. Viabilitatea celulei a fost estimată prin măsurarea absorbanței la 565 nm folosind un cititor de plăci (BioTek, SUA).
Western blot și anticorpi
Cu o zi înainte de ziua experimentală, celulele preadipocite 3 × 10 5 3T3L1 au fost placate în plăci cu 12 godeuri și formula PPC/DC, PPC sau DC a fost aplicată așa cum se indică în figuri. Preadipocitul 3T3L1 a fost diferențiat în adipocite în conformitate cu protocolul de diferențiere a adipocitelor prezentat mai sus. După confirmarea diferențierii adipocitelor prin vizualizarea formării de vacuole lipidice utilizând colorarea cu ulei roșu O, adipocitele diferențiate au fost tratate cu formula PPC/DC, PPC sau DC. Probele de proteine au fost preparate în 120 μl de tampon de liză (10 mM Tris (pH 7,4), EDTA și 1% SDS suplimentat cu un inhibitor de proteinază (Roche)), precum și o placă cu 24 de godeuri. Pentru analiza imunoblot, anticorpii primari pentru PPARγ, C/EBPα, FABP4, α-tubulină, HSP90 α/β (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, SUA), PARP, caspază-3 și fosfo-hormoni sensibili au fost utilizate lipaza (HSL) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) și anticorpii secundari pentru IgG anti-iepure sau anti-șoarece conjugat cu HRP (Thermo Fisher, SUA).