Efectul descărcării urmat de reîncărcare asupra expresiei colagenului și a factorilor de creștere asociați în
Abstract
Mecanismele pentru reglarea mecanică a expresiei colagenului par legate de anumiți factori de creștere receptivi la stres, inclusiv factorul de creștere transformant-β1 (TGF-β1) și factorul de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF), care sunt exprimate ca răspuns la stimuli mecanici și, la rândul lor, conduc la inducerea expresiei colagenului în multe tipuri de celule (16, 25, 32, 44, 50). De asemenea, factorul de creștere tip insulină I (IGF-I) este cunoscut pentru a induce sinteza colagenului în celulele tendinoase (1, 37), iar dovezile recente susțin un rol pentru IGF-I și TGF-β1 ca mediatori ai expresiei induse de încărcare a ARNm de colagen în tendonul șobolanului in vivo (23). Pe baza acestui fapt, se poate specula că o scădere a sarcinii mecanice ar putea influența expresia acestor factori de creștere în țesutul tendinos.
La nivelul mușchilor scheletici, numeroase studii confirmă efecte nocive substanțiale ale descărcării atât la nivel biomecanic, cât și la nivel biochimic (51). În legătură cu modificările exprimării genelor, aceste studii s-au concentrat în principal pe expresia factorilor legați de funcțiile contractile și metabolice, dar există indicii că expresia genelor legate de matrice este, de asemenea, afectată de scăderea nivelurilor de încărcare mecanică (3, 20, 24, 47). Cu toate acestea, reglarea coordonată a ECM musculară și expresia genei țesutului tendinos a fost studiată doar ca răspuns la denervarea pe termen lung (6). Astfel, răspunsul timpuriu la dezutilizare nu a fost studiat simultan în aceste țesuturi. Mai mult, efectul unei perioade ulterioare de reîncărcare asupra expresiei factorilor de creștere și a genelor legate de matrice nu a fost niciodată studiat la nivelul tendonului și, de asemenea, pentru datele musculare sunt rare pe acest subiect.
În studiul de față am folosit modelul de suspensie a membrelor posterioare pentru a investiga efectul unei pierderi a încărcării active a țesutului muscular și tendinos, fără o pierdere concomitentă de stres cardiovascular. O paralelă clinică cu aceasta ar putea fi o situație de leziune, care nu are legătură cu mușchiul și țesutul tendinos, cum ar fi o entorsă a gleznei, în care se evită purtarea greutății piciorului rănit. Suspensia membrelor posterioare a fost urmată de o perioadă de purtare normală a greutății, corespunzătoare unei perioade de reabilitare.
Pe baza studiilor anterioare care indică un efect negativ al descărcării asupra expresiei colagenului de tip I și III în mușchiul scheletic (3, 20, 24, 47), am emis ipoteza că descărcarea membrelor posterioare ar duce la o scădere a expresiei colagenelor fibrilare în mușchi și, eventual, în tendon, urmată de o creștere a expresiei în timpul reîncărcării.
În același model, am studiat efectul asupra expresiei factorilor de creștere legați de reglarea expresiei colagenului, inclusiv variantele de îmbinare TGF-β1, IGF-I [IGF-IEa și factorul de creștere mecanică (MGF)] și CTGF. Având în vedere corelația pozitivă dintre încărcarea mecanică, expresia factorului de creștere și expresia colagenului, s-ar putea specula că descărcarea ar duce la o scădere a acestor factori de creștere receptivi la stres, împreună cu o scădere a expresiei colagenului atât în tendon cât și în mușchi. Cu toate acestea, studiile asupra țesutului osos și al mușchilor scheletici indică faptul că este posibil să nu existe o corelație negativă între descărcarea țesutului și expresia locală a factorilor anabolizanți (2, 7, 18, 19, 24, 41). Astfel, pe baza constatărilor anterioare, nu ne-am așteptat să vedem o scădere a expresiei factorilor de creștere a mușchilor ca răspuns la suspensia membrelor posterioare, în timp ce răspunsul tendonului a fost dificil de prezis. Ca și în cazul expresiei colagenilor, ne așteptam ca perioada de reîncărcare să ducă la niveluri crescute de exprimare a factorului de creștere.
În cele din urmă, am investigat expresia miostatinei, un important regulator negativ al creșterii musculare. Studiile anterioare au arătat o reglare ascendentă a acestui factor în mușchi ca răspuns la suspensia membrelor posterioare (17), în timp ce încărcarea rezistenței pare să reducă expresia miostatinei (29). Astfel, ne-am așteptat să vedem o creștere inițială a expresiei miostatinei musculare în timpul suspendării membrelor posterioare, urmată de o reglare descendentă în timpul reîncărcării. În tendon am observat anterior niveluri relativ scăzute ale transcrierii miostatinei și niciun răspuns la încărcarea crescută. Cu toate acestea, efectul descărcării nu a fost investigat anterior în acest țesut și nu poate fi exclus faptul că acest lucru poate afecta expresia miostatinei.
Suspensia membrelor posterioare și pregătirea țesuturilor.
Suspensia membrelor posterioare (HS) a fost indusă la șobolani Sprague-Dawley femele cu o greutate de 265 ± 2,5 g (înseamnă ± SE) printr-o tehnică neinvazivă de turnare a cozii, așa cum este descris anterior (46). Pe scurt, un sistem de cablaj pivotant, combinat cu o piesă turnată, a fost atașat la un cârlig din partea superioară a cuștii. Acest lucru a împiedicat șobolanii să atingă pământul cu membrele posterioare, dar le-a permis animalelor să se miște în cușcă folosind membrele lor anterioare. Suspendarea a continuat timp de 14 zile, după care au fost îndepărtate turnările și au urmat 16 zile de reîncărcare (RL). Șobolanii au urmat un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12 ore și au avut acces ad libitum la chow și apă standard de șobolan. Studiul a fost realizat în conformitate cu Societatea Fiziologică Americană „Principiile directoare în îngrijirea și utilizarea animalelor”, iar protocolul a fost aprobat de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, Irvine.
Mușchiul soleului, inclusiv tendonul lui Ahile, a fost îndepărtat bilateral după o perioadă de suspendare de 7 zile (ziua 7 HS) sau 14 zile (ziua 14 HS), sau după 2 (ziua 2 RL), 4 (ziua 4 RL), 8 (ziua 8 RL) sau 16 (ziua 16 RL) zile de reîncărcare = 8 în fiecare grup). Comenzi potrivite vârstei pentru ziua 0 (ziua 0 con), ziua 14 HS (ziua 14 con), și ziua 16 reincarca (ziua 16 RL con) au fost incluse = 8 pentru fiecare grup). Țesutul a fost înghețat rapid și depozitat la -80 ° C până la utilizare ulterioară.
Extracția ARN-ului.
ARN-ul a fost extras din țesuturile provenite din abdomenul mușchiului soleului și din tendonul lui Ahile cu utilizarea reactivului TRI (MRC), conform metodei descrise de Chomczynski și Sacchi (10). După izolarea fazei apoase, ARN a fost precipitat folosind izopropanol. Peleta de ARN a fost apoi spălată în etanol și ulterior dizolvată în apă fără RNază. Toate probele au fost cântărite înainte de extracția ARN. Concentrațiile de ARN au fost determinate prin spectroscopie la 260 nm. O bună calitate a ARN-ului a fost asigurată prin electroforeză pe gel.
RT PCR în timp real.
FIG. 1.Randament ARN (μg/mg) din tendonul lui AhileA) și mușchiul solei () după suspensia membrelor posterioare (HS) și reîncărcare (RL) (bare deschise) în comparație cu șobolanii martor (bare gri). Șobolanii femele Sprague-Dawley au fost supuși HS timp de 7 sau 14 zile (D 7 HS sau D 14 HS), urmat de 2, 4, 8 sau 16 zile de RL (D 2 RL, D 4 RL, D 8 RL, sau D 16 RL). Ziua 0, ziua 0 Control. Valorile sunt medii ± SE. *
tabelul 1. Primeri PCR
COL1A1 și COL3A1, colagen I și respectiv colagen III; TGF-β1, factor de creștere transformant -β1; CTGF, factor de creștere a țesutului conjunctiv; IGF-IEa, factor de creștere asemănător insulinei I-Ea; MGF, factor de creștere mecanică; RPLP0, proteină ribozomală mare P0.
Numărul de probe din fiecare grup.
Opt șobolani au fost incluși în fiecare grup. Pentru tendon, s-au realizat analize satisfăcătoare de ARNm pentru toți șobolanii, cu excepția ziua 14 Grupul HS și ziua 16 Grupul RL con, în care tendoanele a șapte șobolani au fost analizate cu succes. În mod similar pentru mușchi, datele pentru ziua 14 Grupul HS și ziua 16 Grupul RL con se bazează pe șase și respectiv șapte șobolani, în timp ce toate celelalte grupuri includ date de opt șobolani.