Efectele comparative ale conservanților alimentari asupra producției de enterotoxină stafilococică I din
1 Colegiul științei și tehnologiei vieții, Universitatea pentru naționalități din sud-vest, Chengdu 610041, China
Abstract
1. Introducere
Staphylococcus aureus (S. aureus) este un agent patogen bacterian major care provoacă infecții clinice și boli de origine alimentară [1]. Organismul este robust, ceea ce îi permite să crească în multe tipuri de alimente preparate sau depozitate necorespunzător și să producă enterotoxine stafilococice (SE). SE sunt agenții cauzatori ai intoxicației alimentare cu stafilococ (SFP) [2]. Chiar dacă bacteriile pot fi ucise prin tratamentul termic al alimentelor, SE sunt rezistente la căldură. Astfel, deși bacteriile sunt eliminate, toxinele vor rămâne în alimente și vor provoca ulterior SFP [3].
Până în prezent, mai mult de douăzeci și patru de SE și proteine asemănătoare enterotoxinelor stafilococice (SEls) au fost identificate și desemnate SEA la SElY [4-6]. Aceste SE/SE-uri au fost tradițional împărțite în tipuri clasice (SEA-SEE) și noi (SEG-SElY). Se presupune că SE sunt toxinele care provoacă emeză; SEl-urile asociate fie nu au activitate emetică, fie nu au fost încă examinate [4]. În ultimii ani, mai multe studii indică faptul că SEG și SEI pot fi responsabile pentru cazurile de SFP la om [7-9]. Cu toate acestea, kiturile comerciale pentru detectarea imunologică a proteinei SEI nu sunt disponibile în prezent [10, 11]. Astfel, există date foarte limitate privind producția SEI.
Conservanții alimentari sunt folosiți pe scară largă pentru a reduce riscul de otrăvire alimentară. Conservanții convenționali sunt substanțe chimice sintetice precum nitritul de sodiu, benzoatul de sodiu și sorbatul de potasiu. Din cauza efectelor secundare, se reconsideră utilizarea conservanților artificiali [12]. Odată cu creșterea cererii consumatorilor de conservanți naturali pentru a înlocui compușii chimici, se dezvoltă noi produse antimicrobiene de diferite origini, inclusiv produse derivate de la animale (lizozime, lactoperoxidază, chitosan, peptidă antimicrobiană și altele), produse derivate din plante (polifenolici, uleiuri esențiale), peptide antimicrobiene vegetale și altele) și metaboliți microbieni (nisină, natamicină, ε-polilizină, acid organic și altele). Aceste produse trebuie investigate pentru potențialul de a controla agenții patogeni de origine alimentară din alimente.
În acest studiu, efectele comparative ale mai multor conservanți alimentari: nitrit de sodiu, polilizină, chitosan și catehină de ceai asupra creșterii bacteriilor, tu expresia genelor și secreția extracelulară SEI dintr-o penicilină rezistentă S. aureus izolatul H4 asociat cu otrăvirea alimentară a fost detectat pentru a evalua aceste produse pentru a fi utilizate ca agenți antimicrobieni în conservarea alimentelor.
2. Materiale și metode
2.1. Numărarea plăcilor bacteriene
2.2. PCR cantitativ în timp real
PCR cantitativă în timp real a fost utilizată pentru a detecta nivelul relativ de ARNm de tu în S. aureus H4 tratat cu conservanți alimentari. După incubare timp de 24 de ore, 200 mL de suspensie celulară au fost colectate și centrifugate la 10.000
timp de 15 min. Supernatantul a fost recoltat pentru următoarea cuantificare a proteinei SEI și celulele au fost lizate prin tampon TE (10 mmol/L Tris-HCI, 1 mmol/L EDTA, pH = 8,0) suplimentat cu 3 mg/ml lizozimă. ARN-ul total a fost extras cu reactiv TRIzol® (Tiangen, Beijing, China) conform protocolului produsului. Concentrația de ARN a fost detectată într-un spectrofotometru (Biowave II, Biochrom, UK) și 2 μg ARN a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc prin transcriere inversă cu un kit de reactivi PrimeScript® RT (Fermentas Life Science, Hanover, MD, SUA) așa cum este descris în instrucțiunile producătorului.
PCR cantitativă pe bază de fluorescență în timp real a fost efectuată la o temperatură de fluorescență iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Primerii specifici pentru tu gena pe care am clonat-o anterior (numărul de acces GenBank: KT853046.1) au fost sei-qF: 5′-TGCCTTTACCAGTGTTATT-3 ′ și sei-qR: 5′-AGGACAATACTTAAATTCTGCT-3 ′. Acești primeri au fost proiectați cu software-ul Primer Premier 5.0 și specificitatea primerilor a fost testată prin PCR. Condițiile pentru amplificarea PCR au fost 120 s la 95 ° C, urmate de 39 de cicluri de 10 s la 95 ° C, 30 s la 55 ° C și 30 s la 72 ° C. Ciclul de prag (CT) a fost analizat cu un
metoda [14]. FtsZ (grunduri: FtsZ-F 5'-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3 'și FtsZ-R 5'-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3') a fost utilizat ca control de încărcare pentru normalizare.
2.3. Sandwich dublu anticorp ELISA
Sandwich-ul cu dublu anticorp ELISA a fost dezvoltat pentru detectarea secreției SEI din S. aureus H4 cu administrare de conservanți alimentari așa cum s-a descris anterior [13]. Pe scurt, 2,89 μg/ml anticorp monoclonal împotriva SEI în PBS a fost acoperit în placă de microtitrare peste noapte la 4 ° C; placa a fost blocată cu 5% lapte degresat în PBS la 37 ° C timp de 60 min. 0,1 ml supernatant de S. aureus H4 colectat la a 24-a oră a fost adăugat la fiecare godeu la 37 ° C timp de 60 min, spălat extensiv cu PBS conținând 0,05% Tween-20, urmat de incubare cu 0,1 mL, anticorp policlonal împotriva SEI (diluare 1: 1000) la 37 ° C timp de 60 min și spălat din nou. Apoi, 0,1 mL, capră anti-iepure IgG-hrean peroxidază (diluare 1: 6000, Santa Cruz, SUA) a fost adăugată la fiecare godeu la 37 ° C timp de 60 min și spălată din nou. Ulterior, s-au utilizat 0,1 ml soluție de tetrametilbenzidină (TMB) și, în cele din urmă, s-a folosit H2SO4 pentru a termina reacția. Măsurarea a fost efectuată la 450 nm fotometric.