Dieta cronică bogată în grăsime afectează colectarea funcției vasului limfatic la șoareci
Katrin S. Blum
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Sinem Karaman
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Steven T. Proulx
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Alexandra M. Ochsenbein
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Paola Luciani
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Jean-Christophe Leroux
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Christian Wolfrum
2 Institutul de Alimentație, Nutriție și Sănătate, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Schwerzenbach, Elveția,
Michael Detmar
1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,
Conceput și proiectat experimentele: KSB SK STP CW MD. A efectuat experimentele: KSB SK STP. Analiza datelor: KSB SK STP MD. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: AMO PL JCL. Am scris lucrarea: KSB SK STP MD.
Date asociate
Abstract
Introducere
Am urmărit să investigăm dacă și cum obezitatea indusă de dietă afectează morfologia și funcția vasculaturii limfatice. În acest scop, șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) și apoi am efectuat evaluări morfometrice ale vaselor limfatice și am utilizat imagini de înaltă rezoluție cu infraroșu apropiat (NIR) pentru a investiga cantitativ funcția de colectare a vaselor limfatice în piciorul posterior al șoareci in vivo. În trei tulpini de șoareci diferite, am constatat că HFD a fost asociat cu o afectare a funcției de colectare a vasului limfatic. Aceste descoperiri implică faptul că disfuncția limfatică poate fi indusă de expansiunea țesutului adipos.
Materiale și metode
3.1 Modele animale - Declarație de etică
C57BL/6J masculin: Șoareci ICR (n = 20), șoareci FVB (n = 16) și șoareci K14-VEGF-C [13] (n = 8) au fost păstrați în condiții SPF convenționale. Pentru fiecare tulpină, începând cu vârsta de 4 săptămâni, jumătate din șoareci au primit acces ad libitum la chow standard (chow; 11% kcal din grăsimi, 31% kcal din proteine și 58% kcal din carbohidrați; Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Elveția) și cealaltă jumătate până la dieta bogată în grăsimi (HFD; 60% kcal din grăsimi, 20% kcal din proteine și 20% kcal din carbohidrați; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, SUA) timp de 17 săptămâni sau 31 de săptămâni. Șoarecii au fost anesteziați prin i.p. injectarea a 0,2 mg/kg medetomidină și 80 mg/kg ketamină pentru imagistică. Șoarecii au fost sacrificați cu o supradoză de anestezie (1000 mg/kg ketamină/3,5 mg/kg medetomidină) urmată de luxație cervicală. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu protocoalele animale aprobate de Kantonales Veterinäramt Zürich.
3.2 Analiza conținutului de apă
Conținutul de apă a fost analizat așa cum s-a descris anterior [9]. Pe scurt, probele de piele din spate au fost colectate cu pumni de biopsie de 6 mm (Acuderm, Fort Lauderdale, FL, SUA). Probele au fost cântărite după colectare și liofilizate timp de 24 de ore. Ulterior, probele au fost cântărite din nou și s-a calculat pierderea în greutate. Deoarece această procedură a eliminat apa din țesuturi, pierderea în greutate a reprezentat conținutul de apă al țesutului.
3.3 Analize de histologie și imunofluorescență
Criosecțiile cozilor (7 μm) au fost fixate timp de 2 minute în acetonă (–20 ° C) și timp de 5 minute în metanol 80% (4 ° C), spălate în PBS și incubate peste noapte (4 ° C) cu un anti hamster -corp anticodoplanină (clona 8.1.1, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universitatea din Iowa) și anticorp anti-Meca32 de șobolan (1 200, BD Pharmingen, Allschwil), sau anti-iepure anti-LYVE-1 (1 600, AngioBio) și șobolan anti-CD31 (1∶200, BD Pharmingen). Probele au fost apoi incubate timp de 30 de minute cu anticorpi secundari conjugați Alexa488 și Alexa594 (1 200) și Hoechst 33342 (1 1000 000; toți din Invitrogen, Basel, Elveția). Colorarea regulată a hematoxilinei a fost utilizată pentru a colora secțiunile de parafină (8 μm) ale cozii.
3.4 Analize morfometrice și morfologice
Petele de imunofluorescență ale secțiunilor pielii cozii pentru vasele limfatice pozoplanin-pozitive și pentru vasele de sânge Meca32-pozitive au fost examinate pe un microscop Axioskop 2 mot plus (Carl Zeiss, Feldbach, Elveția) și imaginile de la 3 la 5 câmpuri vizuale individuale pe secțiune au fost achiziționate cu o cameră AxioCam MRc cu un obiectiv Plan-APOCHROMAT 10 ×/0,45 NA și software-ul AxioVision 4.7.1 (Carl Zeiss, Feldbach, Elveția). Grosimea epidermei, a dermei și a țesutului adipos a fost determinată pe secțiuni de parafină colorate cu hematoxilină ale pielii cozii. Analizele morfometrice ale vaselor și ale grosimii țesuturilor au fost efectuate cu software-ul ImageJ [14].
3.5 Imunocolorarea întregii monturi
3.6 Imagistica in vivo a funcției vaselor limfatice
Pentru imagistica limfatică a fost utilizat un stereomicroscop Zeiss StereoLumar.V12 adaptat pentru vizualizarea NIR [15]. Videoclipurile au fost înregistrate în timpul injectării intradermice a trasoarelor limfatice specifice P20D680 sau P40D680 în picior [15]. Videoclipuri suplimentare pentru a vizualiza contractilitatea colectării vaselor limfatice care drenează membrul inferior au fost achiziționate înainte și după mecanostimularea locului de injectare. Mecanostimularea a fost efectuată folosind un tampon de bumbac presat ușor pe locul injectării o dată pe secundă timp de zece secunde pentru a stimula absorbția limfatică inițială a trasorului și a demonstra capacitatea sistemului limfatic de a reacționa la o încărcare bruscă de lichid [15]. O analiză a regiunii de interes (ROI) a intensității fluorescenței a fost efectuată pentru a evalua frecvența colectării contracțiilor vaselor limfatice. Răspunsul la mecanostimulare a fost evaluat prin determinarea modificării intensității fluorescenței medii în perioadele de 30 s imediat înainte de mecanostimulare și începând de la 30 s după mecanostimulare.
3.7 Analiza zonei pielii perfuzate
Două-trei imagini NIR ale membrului posterior au fost combinate împreună pentru a obține o imagine de ansamblu asupra întregului picior - inclusiv glezna și treimea distală a membrului superior - utilizând software-ul Photoshop v 5.0 (Adobe Systems). Un ROI dreptunghiular de 6 mm lățime și 15 mm înălțime a fost plasat pe imaginea NIR, luând punctul de mijloc al arcului vasului limfatic colector dorsal ca punct de referință, iar imaginea a fost decupată. Suprafața totală a pielii și zona perfuzată cu vopsea în cadrul imaginii decupate au fost apoi măsurate prin selecție manuală folosind instrumentul lasso poligonal al software-ului Photoshop. Suprafața perfuzată a fost apoi calculată ca procent din suprafața totală a pielii.
3.8 Analize statistice
Toate datele sunt prezentate ca medie ± SD. Mijloacele de grup au fost comparate folosind testul t Student; Corecția lui Welch a fost utilizată în cazul variațiilor inegale, iar testul U Mann-Whitney a fost utilizat pentru comparațiile datelor distribuite în mod normal. P Figura 1A). Conținutul de apă al pielii din spate a fost redus după 17 săptămâni pe HFD (FVB: HFD, 0,41 ± 0,11 mL/g vs. chow, 0,53 ± 0,10 mL/g; P = 0,0405; C57BL/6J: ICR: HFD, 0,34 ± 0,06 mL/g vs. chow, 0,53 ± 0,06 mL/g; P = 0,0013; Figura 1B). O creștere semnificativă a țesutului adipos cu adipocite hipertrofice (Figura 1C și D) a fost detectată în cozi (grosimea stratului subcutanat în HFD, 269,5 ± 18,4 μm față de chow, 150,8 ± 15,9 μm; P Figura 1E).
Creșterea semnificativă a greutății corporale (A) și reducerea conținutului de apă al pielii în pielea din spate (B) după 17 săptămâni de HFD. Colorările hematoxilinei (C, D) și analizele cantitative ale imaginii (E) au relevat o grosime semnificativ crescută a țesutului adipos, dar nu a epidermei sau a dermei, în pielea cozii șoarecilor C57BL/6J: ICR HFD. Petele de imunofluorescență pentru podoplanină (F, G; roșu; vasele limfatice) și Meca32 (H, I; verde; vasele de sânge) și analizele cantitative ale imaginii (J) au relevat o reducere a dimensiunii medii a vaselor limfatice dermice, dar nu și a dimensiunii vaselor de sânge, după HFD. Barele de scară = 100 μm. Datele reprezintă media ± SD. * P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001.