Densitatea, remodelarea și inflamația vaselor limfatice îmbunătățite sunt reflectate de expresia genică

Abstract

Incidența diabetului de tip 2 și a obezității crește rapid la nivel mondial (1). În prezent, insensibilitatea generalizată la insulină este considerată evenimentul patogen central (2) care este frecvent legat de un sindrom metabolic sistemic, o stare de inflamație cronică la nivel scăzut care implică activarea macrofagelor în țesutul adipos (3). Înțelegerile recente indică, de asemenea, factori genetici în dezvoltarea bolii (4). Cu toate acestea, hiperglicemia cronică induce modificări macro și microvasculare extinse (5) care duc la afectarea sistemică a organelor. Vasele mari reacționează la creșterea cronică a glucozei și a metaboliților conduși de glucoză cu arterioscleroză îmbunătățită. Microangiopatia diabetică evocă treptat retinopatia, ducând la orbire ulterioară și nefropatie, cea mai frecventă cauză a insuficienței renale. În piele, microvasculopatia provoacă inflamații prelungite, afectarea vindecării rănilor și ulcere (6).

vaselor

În acest articol, raportăm despre creșterea densității limfatice a microvaselului la nivelul pielii pacienților cu diabet zaharat de tip 2. Prin compararea profilurilor de expresie genică ale celulelor endoteliale limfatice cutanate proaspăt izolate (LEC) de la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 cu cele ale controalelor normoglicemice, am identificat procesele moleculare și celulare reglementate în vasele limfatice, în special, transferul lipidic proinflamator, limfangiogen și îmbunătățit. proprietăți, însoțite de apărare imunitară reglementată în jos, mediatori de apoptoză și transportori compuși mici. Concomitent, am urmărit o infiltrare puternică de macrofage CD68 + dermică, care a determinat niveluri crescute ale factorului de necroză tumorală-α (TNF-α). Un subset de gene dereglate LEC (dLEC) diabetice a fost receptiv la TNF-α și corelat cu remodelarea și inflamația vaselor limfatice, inclusiv chemokina CXCL10, care a dus în mod specific la atracția și aderarea macrofagelor la LECs in vitro. Prin urmare, am obținut primele indicații pentru a cunoaște că sistemul limfatic dermic este implicat activ în progresia manifestărilor cutanate în diabetul de tip 2.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Probele de piele de la pacienții cu diabet zaharat și fără diabet de tip 2.

Studiul a fost aprobat de comitetul local de etică (propunerea nr. 449/2001; 81/2008) și toți pacienții (descriși în tabelul suplimentar 1) au dat consimțământul informat. Probele de piele (n = 4 în fiecare grup) au fost luate din regiunea proximală a picioarelor amputate sau a țesutului abdominoplastic și s-a avut grijă să se excizeze zonele la distanță maximă de modificările inflamatorii sau ulcerate (~ 15 cm).

Analize imunohistochimice.

Colorările imunohistochimice ale secțiunilor de piele încorporate în parafină sau criofixate au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (10). Tabelul suplimentar 2 rezumă anticorpii și diluțiile respective aplicate. Pentru cuantificări, sub excluderea zonelor goale, câmpurile microscopice care nu se suprapun (regiunile de interes [ROI]) de 100 µm 2 (30 de câmpuri per pacient) au fost capturate cu un microscop Olympus VANOX AHBT3. Vasele colorate pozitiv, nucleii celulari și macrofagele au fost numărate în aceste ROI, iar dimensiunea secțiunii transversale (denumită diametru) a vaselor a fost măsurată. Numerele medii au fost calculate pe grup de pacienți și analizate statistic după cum se detaliază mai târziu.

Izolarea ex vivo a LEC dermice.

Microprepararea LEC a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, pielea umană a fost dermatomizată și epidermă și dermă dislocate prin incubare în soluție de dispază (Roche nr. 04942086001). Celulele au fost marcate cu anticorpi într-o procedură în trei etape, cu etape intermediare de spălare și sortate (FACStar Plus; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ca LEC (CD31 + podoplanină pozitivă) și celule endoteliale din sânge (CD31 + podoplanină negativă) cu utilizarea a CD45 ca poartă pentru excluderea leucocitelor.

Izolarea ARN și hibridizarea cipurilor.

Analiza GeneChip a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, ARN-ul total (RNeasy Mini Kit; Qiagen nr. 74104) a fost amplificat (MessageAmp II aRNA Amplification Kit; Ambion nr. AM1751), iar 1 μg de ARN amplificat a fost marcat cu biotină, purificat (MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit, Ambion nr. . AM1791) și hibridizate cu Affymetrix GeneChips (GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays), care au fost scanate cu GeneChip Scanner 3000 7G.

Analiza datelor bioinformatice.

Profilurile de expresie genică dLEC și LEC nondiabetice (ndLEC) au fost analizate cu software-ul GeneSpring GX (Ambion). După corectarea fundalului, datele brute au fost normalizate cu metoda robustă multiarray medie, iar valorile P au fost calculate prin testarea t nepereche. Ulterior, 1.828 seturi de sonde cu P ≤ 0.05 au fost folosite pentru gruparea ierarhică bazată pe entități și condiții în conformitate cu regulile de legare metrică distanță și regulile de legătură centroidă euclidiană. Toate datele au fost depuse în Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) Genn Expression Expression Omnibus (GEO) și sunt accesibile prin numărul de acces GEO GSE38396 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi? acc = GSE38396). O analiză bioinformatică aprofundată suplimentară a fost efectuată prin metoda varianței relative (RVM), care permite analiza statistică a dimensiunilor mici ale eșantionului pe baza unui prag autoadaptativ (11). Cercetările extinse NCBI GEO și PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) au fost modificate pentru a prelua informații despre expresiile genice și relevanța pentru biologia LEC. Ontologia genică (www.affymetrix.com) a fost utilizată pentru a clasifica genele în funcție de funcționalitate. Analiza căilor de ingeniozitate (http://www.ingenuity.com) a fost aplicată pentru a identifica asociații cu funcții particulare, căi canonice și boli.

Reacție în lanț cantitativă de transcriptază inversă - polimerază.

O microgramă de ARN total amplificat a fost transcrisă în ADNc prin transcriptază inversă Superscript II (Invitrogen nr. 18064-014). O listă completă a sondelor este rezumată în Tabelul suplimentar 5.

Cultivarea LEC dermică, stimularea TNF-α și CXCL10 ELISA.

LEC-urile au fost sortate din celule endoteliale microvasculare dermice umane (Promocell nr. C-12260) prin margele magnetice acoperite cu anticorp antipodoplanină. LEC-urile au fost cultivate în mediu bazal endotelial-2 (EBM-2) suplimentat cu 5% FCS și EGM-2-MV SingleQuots (Lonza nr. CC-4147) la 37 ° C și 5% CO2. Pentru stimulările TNF-α, LEC-urile dintre pasajele 5 și 8 crescute până la confluența de 70-80% în plăci cu șase godeuri au fost înfometate peste noapte în EBM-2/0,5% FCS și apoi mediu conținând 10 ng/ml TNF-α (R&D nr. 210-TA-010) timp de 6, 12 și 24 de ore cu sau fără inhibitori de 25 ng/mL ai anticorpului anti-TNF-a. LEC-urile au fost lizate cu tampon RL (Qiagen nr. 79216) și β-mercaptoetanol pentru analiza PCR cantitativă (qPCR) ulterioară. Supernatantele culturii LEC au fost colectate și concentrate de 20 de ori cu unități de filtrare centrifugale (Amicon Ultra-0,5 10K Ultracel R; Millipore nr. UFC501024). Nouăzeci și șase de plăci ELISA au fost acoperite cu supernatante concentrate peste noapte și CXCL10 ELISA a fost efectuat conform protocolului standard (vezi legenda din Fig. 8B Suplimentar). Experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar diferențele statistice între grupuri au fost analizate după cum se detaliază mai târziu.