Creșterea acizilor grași liberi induce inflamația și afectează reactivitatea vasculară la sănătos

Abstract

Pentru a testa posibilele efecte proinflamatorii acute ale acizilor grași, am indus o creștere a concentrațiilor de acid gras gras fără plasmă (FFA) după o perfuzie de lipide și heparină timp de 4 ore la 10 subiecți sănătoși. Am determinat activitatea de legare a factorului nuclear-κB (NF-κB) în celulele mononucleare (MNC), subunitatea p65 a NF-κB, generarea speciilor reactive de oxigen (ROS) prin MNC și leucocitele polimorfonucleare (PMN). De asemenea, a fost măsurată reactivitatea arterei brahiale, utilizând dilatarea mediată de flux postischemică. Activitatea de legare a NF-κB în extractele nucleare MNC a crescut la 163 ± 17% și 144 ± 14% comparativ cu nivelurile bazale la 2 și 4 h (P 2) au participat la studiu (Tabelul 1). Toți participanții au avut o toleranță normală la glucoză, nu au luat niciun medicament, au avut tensiune arterială normală și au avut profiluri lipidice normale de post. Toți voluntarii și-au dat consimțământul scris și informat, iar protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de cercetare umană al Universității de Stat din New York la Buffalo.

acizilor

Protocol.

Participanții au venit la centrul de cercetare clinică la 8.00 a.m., după un post peste noapte de 12 ore. Un cateter a fost introdus în vena antecubitală. A fost obținută o probă de sânge inițială și o emulsie de trigliceride (Liposyn, 10%; Abbott Laboratories, North Chicago, IL) și heparină (0,2 unități · kg -1 -1 min -1) au fost perfuzate la o rată de 50 ml/h pentru 4 ore. Am folosit o concentrație mai scăzută de Liposyn în comparație cu majoritatea studiilor anterioare, deoarece perfuzia cu 20% Liposyn a dus la ser lipemic în care separarea MNC și PMN nu a fost posibilă. Infuzia de trigliceride a fost oprită după 4 ore, iar probele de sânge au fost colectate la 0, 2, 4 și 6 ore. Reactivitatea vasculară a fost, de asemenea, măsurată la 0, 2, 4 și 6 ore. În două ocazii diferite, șapte subiecți au participat la alte două studii în care 0,9% soluție salină fiziologică normală sau 5% dextroză au fost perfuzate timp de 4 ore și probele au fost colectate la 0, 2, 4 și 6 ore.

Izolarea MNC și PMN.

Probele de sânge au fost colectate în Na-EDTA ca anticoagulant. Un total de 3,5 ml din proba de sânge anticoagulată a fost stratificat cu atenție peste 3,5 ml de mediu de izolare PMN (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Probele au fost centrifugate la 450g într-un rotor rotativ timp de 30 de minute la 22 ° C. La sfârșitul centrifugării, două benzi separate în partea de sus a peletei de celule roșii din sânge. Banda superioară este formată din MNC, iar partea inferioară este formată din PMN. Banda MNC a fost recoltată cu o pipetă Pasteur, spălată în mod repetat cu soluția de sare echilibrată Hanks și reconstituită la o concentrație de 4 × 105 celule/ml în soluția de sare echilibrată Hanks. Această metodă oferă randamente> 95% suspensie MNC pură.

Măsurarea generației ROS.

Testul de deplasare a mobilității electroforetice NF-κB.

Testul de întârziere a gelului NF-kB a fost efectuat așa cum s-a descris anterior. Extractele de proteine ​​care se leagă de ADN au fost preparate din MNC-uri prin metoda descrisă de Andrews și colab. (15). Concentrațiile totale de proteine ​​au fost determinate utilizând testul proteinei BCA (Pierce, Rockland, IL). Testul de întârziere a gelului NF-κB a fost efectuat utilizând un kit de detectare a proteinelor de legare NF-κB (Life Technologies, Long Island, NY). Pe scurt, oligonucleotida cu catenă dublă care conține o repetare în tandem a secvenței consens pentru situsul de legare NF-κB a fost radiomarcată cu y-P 32 de kinază T4. Apoi, 5 μg din extractul nuclear s-au amestecat cu tamponul de incubare și amestecul a fost preincubat la 4 ° C timp de 15 min. S-a adăugat oligonucleotidă marcată (60.000 cpm) și amestecul a fost incubat la temperatura camerei timp de 20 min. Probele au fost apoi aplicate pe godeuri de 6% gel de poliacrilamidă fără denaturare. Gelul a fost uscat sub vid și expus la film cu raze X. Densitometria a fost efectuată utilizând software-ul analistului molecular Bio-Rad (Hercules, CA).