Administrarea de infecții filiare sau antigen îmbunătățește toleranța la glucoză la șoarecii obezi induși de dietă
Dr. Marc P. Hübner
Institutul de Microbiologie Medicală, Imunologie și Parazitologie
Spitalul Universitar din Bonn, clădirea 63
Sigmund-Freud-Strasse 25, Bonn, DE-53105 (Germania)
Articole similare pentru „”
- Stare de nervozitate
Abstract
Introducere
Studii transversale recente efectuate în India, Indonezia, China rurală și la aborigenii din Australia au arătat că prevalența infecțiilor cu helminți la pacienții cu T2D este semnificativ mai mică decât în controalele nondiabetice, independent de diferențele socio-economice în ceea ce privește veniturile și nutriția, sugerând că infecțiile cu helminți pot într-adevăr preveniți sau întârziați apariția T2D [15,16,17,18]. Posibile mecanisme de protecție mediate de helminți includ reglarea descendentă a răspunsurilor imune proinflamatorii asociate cu T2D, inducerea răspunsurilor imune de tip 2, promovarea absorbției de acizi grași sau o expresie mai puternică a genelor asociate cu sensibilitatea la insulină. Acest lucru este susținut de constatarea faptului că administrarea unui antagonist al receptorului recombinant (anakinra) pentru a bloca semnalizarea citokinei pro-inflamatorii IL-1β glicemie ameliorată și secreția de insulină de la celulele β-insulă ale pacienților T2D [19]. În mod similar, terapia anti-TNFα a îmbunătățit absorbția glucozei într-un model murin de T2D [20]. Efectul benefic al absorbției îmbunătățite a acidului gras asupra îmbunătățirii sensibilității la insulină a fost demonstrat în continuare în mai multe studii [21,22].
În acest studiu, am investigat dacă L.s. infecție sau L.s. administrarea extractului de viermi adulți (LsAg) îmbunătățește toleranța la glucoză la șoarecii DIO și a analizat posibilele mecanisme de protecție.
Materiale și metode
Declarație de etică
Condițiile de adăpostire a animalelor și procedurile utilizate în această lucrare au fost efectuate în conformitate cu orientările Uniunii Europene privind bunăstarea animalelor. Toate protocoalele au fost aprobate de Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Köln, Germania (87-51.04.2010.A355 și 84-02.04.2014.A131).
Animale și îngrijirea animalelor
Experimentele au fost efectuate folosind șoareci masculi de tip sălbatic (WT) și ΔdblGATA pe un fundal BALB/c, precum și șoareci C57BL/6J WT și C57BL/6 DEREG. Șoarecii BALB/c și C57BL/6J au fost cumpărați de la Janvier Labs (Le Genest-St.-Isle, Franța). Șoarecii BdblGATA au fost inițial obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, Maine, SUA), iar șoarecii DEREG C57BL/6 au fost furnizați de Prof. Dr. Tim Sparwasser și Dr. Katharina Lahl (Centrul TWINCORE pentru Cercetarea Infecțiilor Experimentale și Clinice, Hanovra, Germania). Șoarecii au fost crescuți și adăpostiți la facilitățile pentru animale de la Spitalul Universitar din Bonn. Șoarecii au fost menținuți în cuști ventilate individual cu un ciclu de 12 ore zi/noapte și alimente și apă ad libitum. Începând cu vârsta de 6-8 săptămâni, subseturile de șoareci au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HF) care oferă 60% din calorii din grăsimi (Research Diets, Inc., Brogaarden, Danemarca).
L.s. Infecţie
L.s. infecția a fost efectuată prin infecție naturală așa cum s-a descris anterior [23]. Dacă nu s-a specificat altfel, șoarecii sensibili BALB/c au fost infectați la vârsta de 8-10 săptămâni, la 1-2 săptămâni după debutul dietei IC. Pentru infecția naturală, larvele L3 infecțioase au fost transmise odată cu masa de sânge a celor infectați Ornithonyssus bacoti acarieni. Larvele L3 migrează către cavitatea toracică, unde se transformă în viermi adulți (aproximativ 30 de zile după infectare). În momentul necropsiei, starea de infecție a șoarecilor a fost confirmată prin screening pentru viermi adulți în cavitatea toracică.
Pregătirea și administrarea LsAg
LsAg a fost preparat așa cum s-a descris anterior [24]. Scurt, L.s. viermii adulți au fost recoltați din cavitatea toracică a șobolanilor sau gerbilelor de bumbac infectați și omogenizați mecanic pe gheață în PBS fără endotoxine (PAA, Pasching, Austria) folosind un olar de sticlă steril. După centrifugare la 3.200 g, supernatantul a fost colectat și concentrația de proteină măsurată prin testul Bradford (Cytoskeleton, Denver, Colorado, SUA). Alicote de LsAg au fost stocate pentru utilizare ulterioară la -80 ° C.
Injecții intraperitoneale zilnice de 2 Lg LsAg per șoarece timp de 2 săptămâni au fost administrate șoarecilor masculi C57BL/6J PART în timpul săptămânilor 8-10 sau 12-14 din dieta HF. Controalele au primit cantități egale de PBS steril (PAA). După ultima injecție cu LsAg, toate grupurile de șoareci au fost supuse unui test de toleranță la glucoză (GTT), iar studiile imunologice au fost efectuate la o săptămână după aceea. Într-un alt experiment care utilizează șoareci DEREG C57BL/6 (epuizare în celule T reglatoare) [25,26], grupuri de șoareci au fost plasați pe dieta HF pentru o perioadă de 14 săptămâni. Între săptămânile 8 și 10 și 12 și 14, grupurile au primit fie injecții intraperitoneale zilnice de LsAg (2 μg/șoarece), fie PBS. După administrarea finală a LsAg, șoarecii au fost monitorizați pentru toleranță la glucoză.
Test GTT și de toleranță la insulină
După 6 ore de post, șoarecii au fost injectați i.p. cu 2 g soluție de glucoză pe kilogram de greutate corporală. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate din sângele venei cozii folosind un glucometru (Accu-Check Advantage; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania) imediat înainte și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectarea glucozei. Zona de sub curbă (AUC) a fost obținută prin calcularea ariei dintre axa x și o curbă dată utilizând software-ul GraphPad Prism (versiunea 5.03; GraphPad Software, San Diego, California, SUA). După cum s-a menționat mai sus, într-un experiment separat folosind șoareci DEREG C57BL/6, celulele T Foxp3 + au fost epuizate de două injecții intraperitoneale consecutive de 1 dipg toxină difterică (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) cu 3 și 2 zile înainte de GTT (folosind 1,5 g glucoză/kg greutate corporală).
Pentru testul de toleranță la insulină, alimentele au fost îndepărtate imediat înainte de injectarea insulinei. Insulina (1 U/kg greutate corporală) a fost administrată intraperitoneal, iar nivelurile de glucoză din sânge au fost luate imediat înainte și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectarea insulinei.
Izolarea fracției vasculare stromale a țesutului adipos
Izolarea fracției vasculare stromale (SVF) din țesutul adipos a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [3]. Pe scurt, tampoanele de grăsime epididimale de la șoarecii masculi hrăniți cu o dietă normală sau cu HF au fost excizate și tocate în DMEM/mediu cu conținut scăzut de glucoză conținând 1 g/l D-glucoză, 4 m ML-glutamină (PAA), 25 m M HEPES Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, SUA), 1% BSA (PAA) și 1% penicilină-streptomicină (PAA). Țesutul tocat a fost ulterior tratat cu mediu care conține 1,5 mg/ml colagenază-P (Roche) timp de 20 de minute la 37 ° C. După centrifugare, adipocitele plutitoare au fost aruncate cu supernatantul, iar peleta SVF a fost resuspendată în 1 × tampon de liză a celulelor roșii din sânge (eBioscience, San Diego, California, SUA). După o etapă de spălare, celulele au fost blocate pentru analiza FACS prin incubare cu anti-CD16/anti-CD32 (BD Biosciences, Heidelberg, Germania) în 1 × Ca 2+ - și soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco fără Mg 2+, inclusiv 2 m M EDTA și 1% FCS (PAA) la o concentrație finală de 0,5-1 μg/106 celule timp de 1 oră. Suspensia celulară a fost filtrată ulterior printr-un filtru de 100 μm.