Acumularea de PNPLA3 pe picături de lipide este baza steatozei hepatice asociate PNAS

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: jonathan.cohen @ utsouthwestern.eduhelen.hobbs @ utsouthwestern.edu

Contribuit de Helen H. Hobbs, 19 martie 2019 (trimis spre examinare 4 februarie 2019; revizuit de Edward A. Fisher și Rudi Zechner)

este

Semnificaţie

O variantă de secvență (I148M) în PNPLA3 este un factor de risc genetic major pentru boala hepatică grasă nealcoolică. Anterior, am arătat că PNPLA3 (148M) evită degradarea mediată de ubicuitate și se acumulează la niveluri ridicate pe picăturile de lipide (LD). Aici abordăm modul în care această acumulare este legată de steatoză. Am generat o izoformă activă, rezistentă la ubicuitate, care s-a acumulat pe LD și a crescut nivelul de trigliceride hepatice atunci când este exprimat în ficatul șoarecilor. În schimb, epuizarea PNPLA3 a rezolvat acumularea excesivă de grăsime hepatică asociată cu expresia PNPLA3 (148M). Rezultatele noastre oferă dovezi directe că acumularea de PNPLA3 în sine cauzează ficatul gras și că epuizarea proteinei este o strategie potențială pentru intervenția terapeutică.

Abstract

Boala hepatică grasă nealcoolică (FLD) este o tulburare metabolică în plină dezvoltare în care caracteristicile bolii hepatice asociate alcoolului se dezvoltă la persoanele care consumă puțin sau deloc alcool (1). Acumularea trigliceridelor (TG) în ficat (steatoză hepatică) este prima etapă a tulburării. La un subgrup de indivizi, steatoza este asociată cu un răspuns inflamator (steatohepatită) care poate evolua către ciroză și chiar carcinom hepatocelular (2). Principalul factor de risc pentru FLD nealcoolic este obezitatea, dar factorii genetici joacă un rol major în sensibilitatea (și rezistența) la tulburare (2 ⇓ ⇓ –5). Anterior, am identificat o variantă nesinonimă (I148M) în proteina 3 conținând domeniul fosfolipazei asemănătoare patatinului (PNPLA3) care este asociată cu spectrul complet al FLD atât alcoolic cât și nonalcoolic (6 ⇓ ⇓ ⇓ –10). Deși PNPLA3 (148M) este cel mai frecvent și mai puternic factor de risc genetic pentru FLD nealcoolic (3, 11), mecanismul prin care această variantă crește nivelul TG hepatic rămâne evaziv.

Aici ne întrebăm dacă acumularea de PNPLA3 (148M sau 47A) pe LD este o cauză sau o consecință a steatozei asociate. Dacă acumularea de PNPLA3 în sine este cauzală, atunci acumularea proteinei WT, care este de obicei menținută la niveluri scăzute (16), ar trebui să ducă la FLD. În schimb, reducerea cantității de PNPLA3 (148M) ar trebui să elimine fenotipul FLD. Pentru a testa această ipoteză, am folosit două strategii complementare: În primul rând, am conceput o formă a proteinei WT care a păstrat activitatea, dar a evitat degradarea proteazomală și, astfel, s-a acumulat la niveluri ridicate pe LD. Exprimarea acestei izoforme a cauzat steatoză hepatică la șoareci WT. În al doilea rând, am redus nivelurile de PNPLA3 (148M) pe LD folosind două metode diferite: (i) shRNA pentru a doborî expresia PNPLA3 și (ii) degradarea mediată a proteinei de chimeră (PROTAC) a PNPLA3 Halo-tagged (148M). Ambele strategii au scăzut nivelul PNPLA3 la LD și au redus steatoza hepatică.

Rezultate

Inhibarea autofagiei promovează acumularea de PNPLA3.

Anterior, am arătat că PNPLA3 (WT) este poliubiquitate și degradat de proteazomi (18). Tratamentul cu inhibitorul proteazomului bortezomib are ca rezultat o creștere a PNPLA3 hepatic la șoareci WT, dar nu și la șoareci care exprimă izoforma 148M (18). În schimb, tratamentul cu un inhibitor al macroautofagiei, 3-metiladenina (3-MA), nu a reușit să modifice nivelurile PNPLA3 (18). Cu toate acestea, eficacitatea 3-MA ca inhibitor al macroautofagiei a fost contestată (19). Prin urmare, pentru a evalua în continuare rolul autofagiei în degradarea PNPLA3, am folosit doi inhibitori alternativi ai căii.

În primul rând, am tratat șoareci transgenici care exprimă fie PNPLA3 (WT), fie PNPLA3 (148M) cu clorochină (25 mg/kg) timp de 3 ore (20) (Fig. 1A, Superior). La șoarecii PNPLA3Tg WT, tratamentul cu clorochină a crescut nivelul PNPLA3 la LDs de 20 de ori, comparativ cu controlul vehiculului. Modificările nivelurilor de proteine ​​PNPLA3 nu au fost asociate cu modificările nivelurilor de ARNm PNPLA3 (Fig. 1B). Spre deosebire de șoarecii care exprimă transgena WT, tratamentul cu clorochină nu a avut niciun efect asupra nivelurilor PNPLA3 la șoarecii PNPLA3Tg 148M. Ca un control pozitiv pentru inhibarea autofagiei mediată de clorochină, am monitorizat nivelurile de sequestozom 1 (SQSTM1)/p62, un substrat autofagic (21). Tratamentul cu clorochină a dus la creșteri comparabile ale nivelurilor de p62 la cele două linii de șoareci transgenici. În ciuda nivelurilor crescute de PNPLA3 la șoarecii PNPLA3Tg WT, nu s-a observat nicio modificare a nivelului TG hepatice (Fig. 1A, inferior).