Un set de instrumente pentru a studia funcțiile dipeptidazei 2 nespecifice citosolice (CNDP2) folosind Drosophila ca
Evgeniya N. Andreyeva
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Anna A. Ogienko
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
2 Universitatea de Stat Novosibirsk, Novosibirsk, 630090 Rusia
Tatiana D. Dubatolova
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Anastasiya L. Oshchepkova
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
3 Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Elena N. Kozhevnikova
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Anton V. Ivankin
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Gera A. Pavlova
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Serghei A. Kopyl
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
Alexey V. Pindyurin
1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia
2 Universitatea de Stat Novosibirsk, Novosibirsk, 630090 Rusia
Conferinţă
Date asociate
Toate datele de sprijin sunt incluse în fișierele suplimentare. Materialele generate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorii relevanți la cerere rezonabilă.
Abstract
fundal
Expresia genei CNDP2 este frecvent reglată în sus sau în jos în diferite tipuri de cancer uman. Cu toate acestea, modul în care produsul acestei gene este implicat în creșterea și proliferarea celulelor este puțin înțeles. Mai mult, cunoștințele noastre despre funcțiile ortologilor CNDP2 în organisme model bine stabilite sunt rare. În special, funcția ortologului D. melanogaster al CNDP2, codificată de gena CG17337 (denumită în continuare dCNDP2), este încă necunoscută.
Rezultate
Acest studiu a avut ca scop dezvoltarea unui set de instrumente genetice și moleculare pentru a studia rolurile dCNDP2. Am generat o mutație nulă dCNDP2 (denumită în continuare ∆dCNDP2) utilizând recombinarea omologă (HR) mediată de CRISPR/Cas9 și am constatat că mutanții ∆dCNDP2 sunt homozigoti viabili, morfologic normali și fertili. De asemenea, am generat linii de zbor transgenice care exprimă proteina dCNDP2 marcată eGFP și nemarcată, toate sub controlul promotorului UAS, precum și anticorpi policlonali specifici dCNDP2. Folosind aceste instrumente, demonstrăm că doar una dintre cele două izoforme dCNDP2 prezise este exprimată în diferite țesuturi testate. dCNDP2 a fost detectat atât în citoplasmă, cât și în nucleu și s-a dovedit a fi asociat cu mai multe situri din cromozomii politeni ai glandei salivare.
Concluzii
Gena dCNDP2 nu este esențială pentru viabilitatea zborului în condiții standard de laborator. Modelul de localizare subcelulară a dCNDP2 sugerează că această proteină ar putea avea roluri atât în citoplasmă, cât și în nucleu. Instrumentele genetice și moleculare dezvoltate în acest studiu vor permite caracterizarea funcțională suplimentară a proteinei CNDP2 conservate utilizând D. melanogaster ca sistem model.
Material suplimentar electronic
Versiunea online a acestui articol (10.1186/s12863-019-0726-z) conține materiale suplimentare, care sunt disponibile utilizatorilor autorizați.
fundal
Peptidazele cu specificități diferite ale substratului joacă roluri distincte în metabolismul proteinelor și peptidelor în eucariote. CNDP2 de mamifere (cunoscută și sub numele de carnozin dipeptidază II, CN2, carboxipeptidază asemănătoare glutamatului, CPGL) aparține familiei M20 a metalopeptidazelor și are o specificitate largă a substratului pentru dipeptide [1, 2]. Este activ doar ca homodimer [3], iar domeniul catalitic al fiecărei subunități dimerice are un centru activ cu doi ioni Mn 2+ sau Zn 2+, care determină specificitatea enzimei pentru substraturile sale fiziologice [4]. Până în prezent, CNDP2 este singura protează cunoscută care poate cataliza formarea pseudodipeptidelor de acid lactic și aminoacizi (N-lactoil-aminoacizi) prin proteoliză inversă in vivo [5]. Astfel, pe lângă activitatea proteolitică, CNDP2 ar putea îndeplini și alte funcții celulare.
O expresie aberantă a CNDP2 este asociată cu tumorigeneză la om. Un nivel scăzut de CNDP2 a fost observat în cancerul pancreatic, carcinomul hepatocelular și cancerul gastric [2, 6, 7]. Izoforma CNDP2, CPGL-B, căreia îi lipsește o parte din domeniul catalitic, a fost implicată și în suprimarea tumorii, dar în prezent nu se știe dacă CPGL-B are activitate peptidazică [2, 6, 7]. Cu toate acestea, nu toate tumorile sunt caracterizate de niveluri scăzute de CNDP2. O expresie reglată în sus a CNDP2 a fost într-adevăr observată în carcinomul mamar și în cancerele de rinichi și colon [8-11]. Mai multe studii au fost dedicate înțelegerii contribuției CNDP2 la carcinogeneză [2, 6-11], dar un model animal cu CNDP2 mutant nu este disponibil în prezent.
Proteina CNDP2 este extrem de conservată în toate speciile [1, 12-14] și exprimată în mod omniprezent ([1]; O bază de date a genelor și genomilor Drosophila disponibilă de pe flybase.org [15]). În celulele umane și de șoarece, CNDP2 se localizează în citosol și nucleoplasmă (Atlasul Proteinelor Umane disponibil de pe www.proteinatlas.org [16]); în celulele ovarului de hamster chinez (CHO) transfectat tranzitoriu, CNDP2 a fost găsit în fracția citoplasmatică [1]. În D. melanogaster, există o singură genă CNDP2 (CG17337; flybase.org [15]), denumită în continuare dCNDP2. Alinierea secvențelor de aminoacizi a celei mai lungi izoforme a CNDP2 uman (475 aminoacizi; Nr. Acces GenPept> NP_060705.2) și cea mai lungă izoformă a Drosophila dCNDP2 (478 aminoacizi; Nr. Acces GenPept> NP_610181.2) a relevat 63 % identitate secvență pe toată lungimea polipeptidei. Dintre puținele gene D. melanogaster care codifică proteinele metalopeptidazei M20, numai dCNDP2 este exprimat omniprezent cu nivel moderat până la nivel ridicat (flybase.org [15]). Produsul acestei gene s-a dovedit a fi o componentă extracelulară a hemolimfei larvare [17, 18], dar localizarea sa subcelulară este necunoscută.
Pentru a aborda rolul CNDP2 în creșterea și proliferarea celulelor, am decis să exploatăm D. melanogaster ca sistem model. Ușurința manipulărilor genomice la muște permite investigarea proceselor atât la nivel organic, cât și celular. În acest studiu, am generat un mutant nul dCNDP2, linii transgenice pentru expresia inductibilă a dCNDP2, anticorpi policlonali împotriva dCNDP2 și am folosit aceste instrumente pentru a furniza o caracterizare inițială a proteinei.
Metode
Stocuri de zbor
Muștele au fost ridicate și încrucișate la 25 ° C conform procedurilor standard. Au fost utilizate următoarele linii de la Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN; bdsc.indiana.edu): # 1824 (y 1 w *; P + mW.hs = GawB> AB1); # 32186 (w *; P + t7.7 w + mC = 10xUAS-IVS-mCD8: GFP> attP40); # 4775 (w 1118; P + mC = UAS-GFP.nls> 14); # 24488 (y 1 MZH-2A w *; MZH-102D); # 51325 (w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> VK00027) și # 6599 (y 1 w 67c23) ca control de tip sălbatic. Stocul care transportă transgenul nanos-Cre [19] și linia PattP154 [20] au fost furnizate cu amabilitate de Stepan N. Belyakin și respectiv de Sergei A. Demakov (IMCB SB RAS, Novosibirsk, Rusia).