Un potențial protonic ridicat acționează un mecanism de producție a speciilor reactive de oxigen în

Departamentul de Bioenergetică, A.N. Institutul de biologie fizico-chimică Belozersky, Universitatea de Stat din Moscova, Moscova 119899, Rusia

Autorul corespunzator. Fax: (7) (95) 939 03 38 sau (7) (95) 939 31 81. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Bioenergetică, A.N. Institutul de biologie fizico-chimică Belozersky, Universitatea de Stat din Moscova, Moscova 119899, Rusia

Autorul corespunzator. Fax: (7) (95) 939 03 38 sau (7) (95) 939 31 81. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Bioenergetică, A.N. Institutul de biologie fizico-chimică Belozersky, Universitatea de Stat din Moscova, Moscova 119899, Rusia

Abstract

Formarea H2O2 a fost studiată în mitocondriile inimii șobolanilor, pretratate cu H2O2 și aminotriazol pentru a reduce capacitatea lor antioxidantă. Se arată că viteza de formare a H2O2 de către mitocondriile care oxidează succinat de 6 mM este inhibată de un decuplator protonofor, ADP și fosfat, malonat, rotenonă și mixotiazol și este stimulată de antimicina A. Efectul ADP este abolit de carboxiatractilat și oligomicină. Adăugarea decuplatorului după rotenonă induce o inhibare suplimentară a producției de H2O2. Inhibarea formării H2O2 prin decuplare, malonat și ADP + Pi se arată a fi proporțională cu scăderea ΔΨ de către acești compuși. Se găsește o valoare threshold prag, peste care are loc o creștere foarte puternică a producției de H2O2. Acest prag depășește ușor nivelul stării 3 ΔΨ. Datele obținute sunt în concordanță cu conceptul [Skulachev, VP, Q. Rev. Biofizi. 29 (1996), 169-202] că o forță motrice ridicată a protonului în starea 4 este potențial periculoasă pentru celulă datorită creșterii probabilității de formare a superoxidului.

1. Introducere

În 1973, Boveris și Chance [1] au descoperit că un decuplator de fosforilare oxidativă (CCCP) sau ADP + Pi a inhibat formarea H2O2 prin mitocondriile oxidând succinat și glutamat. Mai târziu, Liu și Huang [2, 3] au raportat o dependență foarte abruptă a producției de O −⋅ 2 și H2O2 de către mitocondrii la nivelul ΔΨ de pe membrana mitocondrială. În experimentul lor, ΔΨ a fost redus prin adăugarea de concentrații diferite de malonat, ceea ce scade rata de respirație a stării 4. Prin urmare, s-ar putea sugera că formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) este mai degrabă o funcție a transportului de electroni din lanțul respirator decât de (.

Grupul nostru a propus [4-6] ca activarea producției de ROS în starea 4, atunci când potențialul protonic este ridicat și rata respirației este limitată de lipsa ADP, se datorează faptului că unii tranzitori ai transportului de electroni ai lanțului respirator, capabili să reducă O2 până la O −⋅ 2, cum ar fi CoQH ⋅, devin de lungă durată. S-a presupus că mitocondriile sunt echipate cu un mecanism special („decuplare ușoară”) care împiedică potențialul protonic să fie prea mare.

În această lucrare, investigăm din nou problema relațiilor mitocondriale ROS - potențial protonic. S-a constatat că orice scădere a stării 4 ΔΨ a dus la o puternică inhibare a formării H2O2 de către mitocondrii, indiferent dacă s-au adăugat activatori (decuplator sau ADP + Pi) sau inhibitori (malonat) ai transportului de electroni pentru a determina o scădere a ΔΨ. S-a găsit o valoare prag threshold necesară pentru creșterea generației de H2O2.

2. Materiale și metode

Mitocondriile au fost izolate din mușchiul inimii șobolanilor. Mușchii răciți, purificați de grăsime și tendoane, au fost tocate și trecute printr-o presă din oțel inoxidabil cu găuri cu diametrul de aproximativ 1 mm. Țesutul a fost apoi omogenizat timp de 3 minute cu un pistil de teflon într-un omogenizator de sticlă (Pyrex), raportul țesut: amestec de izolare fiind de 1: 8. După prima centrifugare (10 min, 700 ×g), supernatantul a fost decantat și filtrat prin tifon, apoi centrifugat (10 min, 16.000 ×g). Sedimentul a fost suspendat în amestec de izolare de 1 ml (250 mM zaharoză, 10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 7,4) suplimentat cu BSA (3 mg/ml). Apoi amestecul a fost centrifugat încă o dată și spălat cu mediul de izolare fără BSA (10 min, 16 000 ×g). Sedimentul mitocondrial final a fost suspendat în amestecul de izolare (70-90 mg proteină/ml) și depozitat pe gheață.

În toate experimentele prezentate în figuri, procedura de mai sus a fost completată cu tratamentul mitocondriilor cu 2 mM H2O2 și 7 mM aminotriazol care au fost adăugați la supernatant înainte de a doua centrifugare.

Consumul de oxigen a fost înregistrat cu un electrod de oxigen de tip Clark și un polarograf Rank Brothers.

Nivelul ΔΨ a fost estimat utilizând safranina O. Raportul dintre colorant (nmol) și proteină mitocondrială (mg) a fost de 20: 1. Trebuie remarcat faptul că s-a demonstrat că răspunsul safraninei O depinde liniar de ΔΨ în regiunea 50-170 mV [7-9] .