Trombopoietina și trombina induc fosforilarea tirozinei Vav în trombocitele de sânge uman

  • Ecran divizat
  • Pictogramă Partajare Acțiune
    • Facebook
    • Stare de nervozitate
    • LinkedIn
    • E-mail
  • Pictogramă Instrumente Instrumente

    • Yoshitaka Miyakawa, Atsushi Oda, Brian J. Druker, Katsutoshi Ozaki, Makoto Handa, Hideya Ohashi, Yasuo Ikeda; Trombopoietina și trombina induc fosforilarea tirozinei Vav în trombocitele de sânge uman. Blood 1997; 89 (8): 2789-2798. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V89.8.2789

      induc

      Descărcați fișierul de citare:

      Abstract

      Accentul acestui raport este produsul proto-oncogen Vav, o proteină de 95 kD exprimată în principal în celulele hematopoietice. 10-20 Dacă Vav este esențial în hematopoieză este o problemă controversată. 17-20 Cu toate acestea, un raport recent sugerează că Vav poate fi indispensabil pentru eritropoieza la adulți. 21 Se știe că citokinele multiple și factorii de creștere hematopoietici induc fosforilarea tirozinei Vav. 10-16 În plus, mai multe rapoarte indică faptul că Vav are un rol major în semnalizarea prin receptorii de antigen ai celulelor T și B din celulele limfoide.22-24

      Având în vedere prezența receptorilor funcționali ai trombopoietinei pe trombocite și existența proteinelor de 95 până la 85 kD ca proteine ​​majore fosforilate de tirozină după stimularea trombocitelor cu trombopoietină2, am examinat dacă trombocitele pot avea proteină Vav și dacă devine tirozină fosforilată după tratamentul cu trombopoietina. Arătăm că trombopoietina induce o creștere a fosforilării tirozinei Vav în trombocite, fără o creștere a concentrației de calciu ionizat citosolic ([Ca 2+] i) sau activarea protein kinazei C. Trombina, U46619, colagen sau forbol 12-miristat 13 acetat (PMA), toate despre care se știe că activează protein kinaza C, 25 induc, de asemenea, o creștere a fosforilării tirozinei Vav. Trombina induce redistribuirea Vav în reziduul insolubil Triton X-100 într-un mod dependent de agregare. În cele din urmă, similar multor proteine ​​încorporate în reziduul insolubil Triton X-100 după agregarea trombocitelor, cum ar fi proteina integratoare β3, p60 c-src, talină și actină, am constatat că Vav este un substrat endogen pentru calpaină, sugerând că Vav poate avea un rol în evenimente postagregare.26-34

      MATERIALE ȘI METODE

      Prepararea trombocitelor. Sângele uman de la voluntari sănătoși a fost extras prin puncție venoasă în 1/10 volum de 3,8% (greutate/vol) citrat trisodic și amestecat ușor. Plasma bogată în trombocite (PRP) a fost preparată prin centrifugarea întregului sânge la 200g timp de 20 de minute și aspirarea PRP. PRP a fost incubat cu aspirină (2 mmol/L) timp de 30 de minute la temperatura camerei. S-a adăugat PGE1 (1 μmol/L) dintr-o soluție stoc în etanol absolut (1 mmol/L). PRP a fost filat la 800 g pentru a forma o peletă moale de trombocite. Peleta a fost resuspendată în 1 ml dintr-un tampon HEPES-Tyrode modificat (129 mmol/L NaCl, 8,9 mmol/L NaHCO3, 0,8 mmol/L KH2PO4, 0,8 mmol/L MgCl2, 5,6 mmol/L dextroză și 10 mmol/L HEPES, pH 7,4) conținând și pirază (2 U/ml) și spălat de două ori. Trombocitele au fost resuspendate în același tampon la o concentrație de 3 × 108 celule/ml cu pirază (2 U/ml) conținând 1 mmol/L CaCl2 la 37 ° C.

      Linii celulare. O linie celulară dependentă de trombopoietină (FDCP-hMpl5) a fost stabilită anterior prin transformarea celulelor FDCP-2 cu o plasmidă de expresie care conține cDNA c-mpl uman de lungime completă condusă de repetarea terminală lungă a virusului sarcomului Moloney murin. 3,37,38 Înainte de tratarea celulelor cu reactivi, acestea au fost incubate în IMDM conținând 10% ser fetal de vițel (FCS) fără interleukină exogenă (IL) -3 timp de 6 ore. După două spălări, au fost incubate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; pH 7,4).

      Imunoprecipitare. Stimularea celulei a fost încheiată prin adăugarea unei cantități egale de tampon de liză (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/ml leupeptină, 2% Triton X-100 (V/W), pH 7,4). După 20 de minute pe gheață, lizatele au fost centrifugate la 10.000 g (la 4 ° C) timp de 20 de minute. Supernatantul a fost îndepărtat și incubat cu ser preimun și proteină A-Sepharose (40 μL de suspensie 50%) timp de 1 oră. Anticorpii policlonali sau monoclonali doriți au fost apoi adăugați și incubați timp de 2 până la 3 ore pe gheață. S-a adăugat agaroză conjugată IgG cu proteină A-Sepharose sau antimouse (40 μL de suspensie 50%) și incubată timp de câteva ore. Complexele imune au fost spălate cu 1 ml tampon de spălare la rece (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCI, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/ml leupeptină, 1% Triton X-100 [vol/greutate], pH 7,4) de trei ori și apoi resuspendat în tamponul de probă al lui Laemmli.

      Izolarea citoscheletului trombocitar definit operațional. Citoscheletul insolubil Triton X-100 a fost izolat așa cum s-a descris cu următoarea modificare. 36 Pe scurt, o cantitate egală de tampon de liză (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/mL leupeptină, 2% Triton X-100 [vol/greutate], pH 7,4) a fost adăugat la suspensiile de trombocite pentru a solubiliza trombocitele. După 5 minute pe gheață, lizatele au fost centrifugate la 10.000 g. Peleta rezultată a fost spălată de două ori în tampon de spălare (145 mmol/L NaCI, 0,1 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/L PMSF, 5 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,4 μg/mL leupeptină, 1% [ vol./greutate] Triton-X 100, pH 7,4). Pentru electroforeza SDS unidimensională, reziduul insolubil Triton X-100 a fost solubilizat în tampon de probă SDS. Supernatantul a fost diluat cu un volum egal de tampon de probă SDS concentrat de două ori.

      Încărcarea trombocitelor cu 32 Pi și analiza proteinelor fosforilate. Detectarea fosforilării lanțului ușor de miozină și a pleckstrinei a fost efectuată așa cum a fost descris cu următoarele modificări. 40 Peletele moi de trombocite, preparate așa cum s-a descris mai sus, au fost resuspendate în tamponul HEPES-Tyrode modificat fără KH2PO4, dar cu pirază (2 U/ml) și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei. Trombocitele spălate au fost preparate așa cum s-a descris mai sus. Trombocitul lizat a fost preparat și analizat pe 7,5% până la 15% SDS-PAGE. 39 Gelurile au fost uscate și autoradiografiate cu filme X-Omat (Eastman Kodak, Rochester, NY).

      REZULTATE

      Au fost utilizate antiseruri specifice împotriva Vav pentru a determina dacă Vav este prezent în trombocitele umane. Aceste antiseruri recunosc o bandă de 95 kD în lizatele din trombocitele umane care conigrează cu o bandă de 95 kD în lizatele din celulele Jurkat, care exprimă Vav, indicând faptul că trombocitele au Vav (datele nu sunt prezentate). 41-43 La fel ca în alte celule hematopoietice, am constatat că Vav este asociat în mod constitutiv cu Grb2, o proteină adaptoare SH2/SH3 (datele nu sunt prezentate) .11,44

      Am examinat dacă Vav devine tirozină fosforilată în trombocite tratate cu trombopoietină. Trombocitele tratate cu trombopoietină (100 ng/ml) de mai multe ori au fost lizate într-un tampon conținând 1% Triton X-100 și imunoprecipitate cu antiseruri Vav specifice. Aceeași cantitate de proteină de 95 kD recunoscută de antiserurile Vav a fost imunoprecipitată din toate lizatele celulare (Fig. 1A, panoul inferior). După tratamentul cu trombopoietină, aceeași proteină a fost din ce în ce mai tirozină fosforilată peste nivelul bazal scăzut (Fig. 1A, panoul superior). Astfel, trombocitele au Vav, care devine tirozină fosforilată după tratamentul cu trombopoietină al trombocitelor umane. Trombina (1 U/mL), colagenul (10 μg/mL) sau U46619 (1 μmol/L) și tromboxanul mimetic, induc, de asemenea, fosforilarea tirozinei Vav în trombocite (Fig. 1B și C). Trebuie remarcat faptul că adăugăm în mod obișnuit peptida RGDS (200 μg/ml) la suspensiile de trombocite și agitarea minimă în prezența agoniștilor pentru a diminua efectele legării fibrinogenului la α IIbβ3 și a agregării ulterioare, care influențează profund fosforilarea tirozinei proteinelor trombocitare.34, 45