Stimularea transmiterii noradrenergice de către reboxetină este benefică pentru un model de șoarece
Subiecte
Abstract
Introducere
Boala Parkinson (PD) este a doua cea mai frecventă tulburare neurodegenerativă, afectând până la 3% din populațiile vârstnice (> 65 de ani). PD se caracterizează prin deficite motorii, cum ar fi tremor, rigiditate și bradikinezie 1. Aceste simptome sunt cauzate în principal de pierderea neuronilor dopaminergici localizați în substanța neagră (SN) și zona tegmentală ventrală (VTA). Deoarece peste 90% din cazurile de PD sunt de origine sporadică, s-au înregistrat puține progrese în tratamentul bolii. În ultimii 40 de ani, cercetătorii s-au concentrat pe îmbunătățirea farmacologică a transmisiei dopaminergice, care este de obicei pusă în aplicare atunci când majoritatea neuronilor au dispărut deja.
Acest studiu a urmărit să înțeleagă dacă îmbunătățirea farmacologică a transmisiei noradrenergice realizată fie prin aplicarea cronică a unui inhibitor selectiv al recaptării NA (reboxetină, REB), fie a unui antagonist alfa2-AR (atipamezol, APM) poate ameliora efectele motorii ale pierderii progresive a neuronilor dopaminergici și dacă această stimulare noradrenergică poate avea efecte benefice asupra supraviețuirii neuronale dopaminergice și a conținutului de dopamină striatală într-un model de șoarece de parkinsonism progresiv.
Pentru a testa această ipoteză, am folosit un model condiționat de șoarece knock-out lipsit de factorul de inițiere a transcripției-IA (TIF-IA) caracterizat prin inhibarea inductibilă a unei funcții celulare fundamentale, cum ar fi sinteza ARNr în neuroni dopaminergici pentru a provoca neurodegenerarea lor progresivă 11 . Acești șoareci mutanți imită multe semnale distinctive ale PD, inclusiv vulnerabilitatea progresivă și selectivă a neuronilor SN, deficitele de coordonare motorie, precum și creșterea disfuncției mitocondriale și creșterea deteriorării stresului oxidativ 11. Important, așa cum s-a arătat anterior, unele dintre efectele acestei mutații pot fi parțial salvate prin administrarea L-DOPA 11, precum și prin inhibarea căilor de semnalizare pro-apoptotice, cum ar fi p53 și îmbunătățirea regulatorului principal al sintezei proteinelor, ținta mecanicistă de rapamicină (mTOR) 11,12, susținând utilizarea lor potențială ca model pentru terapiile care modifică boala împotriva neurodegenerării dopaminergice.
Materiale și metode
Animale
Ablația selectivă a TIF-IA la neuroni dopaminergici (șoareci TIF-IA DATCreERT2) a fost realizată folosind Cre/loxP abordare. Găzduirea șoarecilor transgenici Cre recombinaza sub promotorul transportorului de dopamină (DAT) (șoarecii DAT CreERT2) au fost încrucișate cu animale care adăpostesc gena TIF-IA cu oxigen, așa cum s-a descris anterior 11. Șoarecii mutanți masculi și femele au fost ținuți cu colegii lor de control (Cre-negativi) de același sex în cuști auto-ventilate în condiții standard de laborator (12 ore ciclu lumină/întuneric, hrană și apă ad libitum). Studiul a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Institutele Naționale de Sănătate. Protocolul pentru toate studiile comportamentale a fost aprobat de Comitetul etic al animalelor de la Institutul de farmacologie, Academia Poloneză de Științe (Număr permis: 951/2012, eliberat: 28.06.2012).
Droguri și program experimental
Pentru a activa recombinaza CreERT2 dependentă de tamoxifen la șoareci adulți (12 săptămâni) și a induce mutația, am aplicat tamoxifen (TAM) (Sigma-Aldrich, SUA) dizolvat în ulei la o doză de 1 mg/șoarece, de 2 ori pe zi timp de 5 zile consecutive, cu 4 săptămâni înainte de administrarea medicamentelor investigate. Animalele de control (w/t) au primit ulei singur. Reboxetina (REB) (Tocris Bioscience, SUA) și atipamezolul (APM) (Antisedan, Orion Pharma, Polonia) au fost administrate o dată pe zi, timp de 21 de zile consecutive, la doze de 20 mg/kg și, respectiv, 3 mg/kg. Grupurile martor au primit 0,9% NaCI. Toate analizele comportamentale și biochimice au fost efectuate la 7, 10 și 13 săptămâni după injecțiile TAM (TAM + 7, TAM + 10, TAM + 13), așa cum se vede în Fig. 1.
Diagramă de flux care rezumă proiectarea experimentală. TAM - tamoxifen, REB - reboxetină, APM - atipamezol; TAM + 7, TAM + 10, TAM + 13: 7, 10, 13 săptămâni după inducerea mutației (aplicarea tamoxifenului).
Test Rotarod
Testul rotarod a fost efectuat pentru evaluarea coordonării motorii. Testul a fost efectuat pe un rotarod accelerat (Ugo Basile, Italia). Evaluarea a fost precedată de o sesiune de antrenament cu o zi înainte de primul experiment (5 minute pe tija rotativă la o viteză constantă). În timpul sesiunilor experimentale efectuate în săptămânile 7, 10 și 13 după injecția cu tamoxifen, a fost măsurat timpul petrecut pe tija de accelerare (4 până la 40 rpm în 5 minute).
Analiza HPLC
Imunohistochimie
Procedura a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 14, cu unele modificări. Pe scurt, creierele au fost îndepărtate, fixate timp de 48 de ore în paraformaldehidă (PFA) 4%, clătite și transferate la 0,4% PFA. După fixare, creierele au fost tăiate pe un vibratom (Leica, Germania) în secțiuni de 30 μm. Secțiunile din creierul mediu, inclusiv SN/VTA, au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorp anti-tirozin hidroxilază primară (TH) (1: 500, Millipore, SUA, nr. Pisică AB1542). Vizualizarea anticorpului primar legat de antigen a fost efectuată utilizând un anticorp secundar biotinilat adecvat urmat de incubare cu Complexul Avidin/Biotin (ABC; Vector Laboratories, SUA) și colorarea diaminobenzidinei (DAB; Sigma, SUA). Secțiunile colorate au fost achiziționate și analizate la microscopul cu lumină (Nikon Eclipse50i, Japonia) echipat cu o cameră și software NIS Elements. Cuantificarea celulelor TH-pozitive (TH +) a fost efectuată manual prin numărarea tuturor celulelor TH + pe secțiuni adiacente de la 6 animale din fiecare genotip/tratament într-un experiment cu un singur orb.
Culturi de celule midbrainiene embrionare primare și tratament medicamentos
analize statistice
Analiza statistică a fost efectuată cu software-ul Graph Pad Prism 7. Datele au fost evaluate prin analiza bidirecțională a varianței (ANOVA bidirecțională, genotip × tratament) cu comparații multiple ale grupurilor relevante din punct de vedere biologic (luând în considerare 3 puncte de timp diferite de analiză), urmate de testul post-hoc LSD Fisher. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.
Rezultate
Tratamentul cu insuficiență motorie ameliorată de reboxetină la șoarecii TIF-IA DATCreERT2
Așa cum este indicat în Fig. 1, am indus ablația condiționată a TIF-IA prin injecție TAM și am început tratamentul de 21 de zile fie cu REB, fie cu APM la 4 săptămâni după TAM, timpul necesar unei recombinări eficiente induse de TAM. Pentru a investiga dacă REB sau APM pot avea vreun efect pozitiv asupra deficitelor motorii declanșate de pierderea progresivă a neuronilor dopaminergici la șoarecii TIF-IA DATCreERT2, am testat animalele de control și cele mutante la trei momente de timp diferite (7, 10 și 13 săptămâni după TAM (TAM + 7, TAM + 10 și TAM + 13) de către rotarod. Pe baza experimentelor anterioare acestea au fost etapele arătate anterior pentru a conduce la un parkinsonism progresiv, începând de la TAM + 7 (fără pierderi celulare) și dezvoltându-se în fenotipul comportamental sever. asociat cu degenerescență dopaminergică profundă la TAM + 13 11. După cum era de așteptat, șoarecii TIF-IA DATCreERT2 tratați cu VEH au relevat o scădere semnificativă a rezistenței (cu 57,7% față de control, animale tratate cu VEH, ANOVA cu două căi: genotipul F (2.218 ) = 12,63; p Figura 2