Ștergerea cardiacă Fibroblast GRK2 îmbunătățește contractilitatea și remodelarea după
Meryl C. Woodall
1 Centrul de Medicină Translațională, Școala de Medicină Lewis Katz, Universitatea Temple, Philadelphia, PA, SUA
Benjamin P. Woodall
1 Centrul de Medicină Translațională, Școala de Medicină Lewis Katz, Universitatea Temple, Philadelphia, PA, SUA
Erhe Gao
1 Centrul de Medicină Translațională, Școala de Medicină Lewis Katz, Universitatea Temple, Philadelphia, PA, SUA
Ancai Yuan
1 Centrul de Medicină Translațională, Școala de Medicină Lewis Katz, Universitatea Temple, Philadelphia, PA, SUA
2 Departamentul de Cardiologie, Spitalul Ren Ji, Facultatea de Medicină, Universitatea Shanghai Jiao Tong, Shanghai, China.
Walter J. Koch
1 Centrul de Medicină Translațională, Școala de Medicină Lewis Katz, Universitatea Temple, Philadelphia, PA, SUA
Date asociate
Abstract
Raţional
Receptorul kinazei 2 cuplate cu proteina G (GRK2) este o moleculă importantă reglată în sus după leziuni miocardice și în timpul insuficienței cardiace. Pierderea GRK2 specifică miocitelor înainte și după leziunea ischemică miocardică îmbunătățește funcția cardiacă și remodelarea. Fibroblastul cardiac joacă un rol important în repararea și remodelarea evenimentelor care urmează ischemiei cardiace; importanța GRK2 în aceste evenimente nu a fost investigată.
Obiectiv
Scopul acestui studiu este de a elucida implicațiile in vivo ale ștergerii GRK2 în fibroblastul cardiac după leziuni de ischemie/reperfuzie (I/R).
Metode și rezultate
Demonstrăm, folosind șoareci knock-out GRK2 inducibili cu tamoxifen, specifici fibroblastelor, că pierderea GRK2 conferă un avantaj protector față de șoarecii martori după leziunea miocardică I/R. Șoarecii knockout Fibroblast GRK2 au prezentat o dimensiune scăzută a infarctului și funcție cardiacă păstrată 24 de ore după I/R, după cum s-a demonstrat prin creșterea fracțiunii de ejecție (58,1 ± 1,8% față de 48,7 ± 1,2% la martori, p Cuvinte cheie: Ischemie miocardică/leziuni de reperfuzie, receptor kinază cuplată cu proteina G 2, fibroblast cardiac, fibroză, inflamație
INTRODUCERE
Leziunea ischemie/reperfuzie (I/R) activează un răspuns inflamator „steril” în care neutrofilele sunt recrutate în zona ischemică de către miocitele necrotice și speciile reactive de oxigen (ROS). 7 Se consideră că infiltrarea excesivă de neutrofile în locul infarctat dăunează supraviețuirii miocitelor, întrucât neutrofilele secretă și ROS, exacerbând în continuare distrugerea celulelor și a țesuturilor. 8 Înțelegerea inflamației și remodelarea după leziuni I/R este importantă pentru dezvoltarea de noi terapii; studii multiple au demonstrat că inhibarea extravazării neutrofilelor reduce deteriorarea țesuturilor și scade dimensiunea infarctului. 9-11 Suntem interesați de semnalele cardiace și de comunicarea celulară dintre miocite și fibroblaste care pot regla sau modifica leziunile tisulare după leziunea I/R.
În timp ce reglarea GPCR în miocite în timpul leziunii ischemice a fost studiată pe larg, semnalizarea fibroblastelor GPCR în timpul leziunii I/R și focalizarea acestui studiu, GPCR kinaza 2 (GRK2), nu a fost bine caracterizată. Rolul principal al GRK2 este de a fosforila GPCR-urile activate de agoniști și de a le viza pentru internalizarea mediată de β-arestină; în inimă, GRK2 este reglat în miocit după rănire și activitatea sa îmbunătățită vizează receptorul β-adrenergic (βAR) pentru a modula contractilitatea. 12-13 Decenii de cercetare au descoperit efectele dăunătoare ale activității crescute a GRK2 în bolile de inimă și au furnizat dovezi cuprinzătoare că pierderea expresiei miocitelor GRK2 sau inhibarea acesteia înainte sau după insulta cardiacă este benefică pentru contractilitatea miocardică și remodelarea cardiacă. 14-16 Studii mai recente s-au extins și asupra versatilității GRK2 prin delimitarea rolurilor necanonice în regulamentul eNOS 17.18, funcția mitocondrială 19.20 și semnalizarea insulinei. 21
În prezent, se știe puțin despre funcția GRK2 în fibroblastul cardiac. În acest studiu am căutat să examinăm dacă pierderea fibroblastului GRK2 ar fi avantajoasă sau dăunătoare funcției cardiace după leziuni ischemice acute in vivo. Folosind șoareci inductibili și condiționați GRK2 knockout (KO), am supus șoareci GRK2 KO specifici fibroblastului la leziuni miocardice I/R și am investigat efectele legate de funcția inimii, fibroză și inflamație. Rezultatele noastre arată clar că, într-o situație acută, pierderea fibroblastului GRK2 este benefică pentru funcția cardiacă și remodelare și că acest lucru poate fi legat de diferențele în recrutarea celulelor inflamatorii în primele ore următoare reperfuziei. De asemenea, am efectuat experimente in vitro pe fibroblaste cardiace neonatale și șoareci adulți proaspăt izolați pentru a obține o perspectivă asupra modului în care fibroblastul poate influența supraviețuirea miocitelor și inflamația cardiacă in vivo.
METODE
Animale experimentale
Pentru a obține șoareci inductibili, specifici fibroblastului GRK2 KO, șoarecii Colagen1α2-CreER (T) 22 (Jackson Labs Stock # 029235) au fost încrucișați cu șoareci GRK2 fl/fl 23 (Jackson Labs Stock # 012458). Puii au fost încrucișați înapoi pentru a genera șoareci Collagen1α2-CreER (T)/GRK2 fl/fl (denumiți GRK2 fKO). Șoarecii GR/2 fl/fl au fost folosiți ca martori de tip sălbatic (WT). Tamoxifenul (Sigma T5648) a fost injectat intraperitoneal (IP) zilnic timp de 10 zile la 40 mg/kg/zi. Toate studiile pe animale au fost realizate cu aprobarea Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Temple University.
Izolarea fibroblastelor și miocitelor cardiace adulte de șoarece
Inimile au fost îndepărtate de la șoareci cu vârsta> 2-3 luni și procesate așa cum s-a descris anterior. 24
Izolarea celulelor măduvei osoase și prepararea lizatului
Femurele au fost îndepărtate de la șoareci cu vârsta> 2-3 luni. Conținutul a fost spălat folosind soluția de sare tamponată a lui Hank (Corning 21-023-CV), o seringă și un ac de calibru 27. Celulele măduvei osoase au fost centrifugate și spălate cu 1X PBS. Celulele au fost resuspendate în tampon RIPA suplimentat cu inhibitori de protează, sonicate și centrifugate pentru a îndepărta resturile celulare.
Izolarea mușchiului neted vascular și a preparatului de lizat
Aortele toracice au fost izolate de la șoareci cu vârsta> 2-3 luni. După spălare în 1X PBS, aortelor li s-a răspuns în tampon RIPA suplimentat cu inhibitori de protează, sonicați și centrifugați pentru a îndepărta resturile celulare.
Izolarea fibroblastelor cardiace neonatale de șobolan
Fibroblastele cardiace neonatale de șobolan sunt izolate ca un produs secundar al izolării miocitelor cardiace cardiace neonatale de șobolan, efectuată așa cum s-a descris anterior 17 .
Imunoblotarea
Anticorpii GRK2 și GAPDH provin de la Santa Cruz. Anticorpii fosfo-AKT și total AKT provin de la semnalizarea celulară.
Model in vivo al leziunii ischemice/reperfuzionale
Leziunea de ischemie/reperfuzie a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 25 Dimensiunea infarctului a fost măsurată așa cum s-a descris anterior. 26
Analiza ecocardiografică transtoracică
Ecocardiografia bidimensională transtoracică a fost realizată orbită așa cum s-a descris. 25
Analiza hemodinamică terminală a funcției cardiace
Analiza hemodinamică a fost efectuată orbită așa cum s-a descris anterior. 25
Măsurarea apoptozei miocardice
Apoptoza miocardică a fost evaluată prin colorarea TUNEL. 18
Evaluarea fibrozei miocardice
Nivelurile de colagen au fost măsurate folosind trusa de colorare Trichrome Masson (Sigma HT15) și kitul de testare a hidroxiprolinei (Sigma MAK008) fără modificări.
Măsurarea nivelurilor AMPc
Fibroblastele cardiace neonatale de șobolan au fost tratate cu izoproterenol 10 μM timp de 15 minute. nivelurile de AMPc au fost măsurate utilizând kitul de analiză AMP XP ciclic (semnalizare celulară 4339) fără modificări.
Imunofluorescența
Inimile au fost recoltate 72 de ore după reperfuzie, fixate peste noapte în paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și tăiate pe axa lungă în secțiuni de 6um. După deparafinare, rehidratare și recuperare a antigenului utilizând soluția de demascare a vectorului antigen (Vector Labs H3300), secțiunile au fost blocate în 10% FBS/1X PBS. Anticorpul primar (α-SMA, Sigma A5228) a fost incubat cu secțiuni peste noapte la 4 ° C. Anticorpul secundar (Life Technologies A21463) a fost aplicat timp de 1 oră la temperatura camerei. Secțiunile au fost tratate cu suport de montare DAPI și acoperite. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată folosind ImageJ. Pentru colorarea fibroblastelor cardiace neonatale de șobolan, celulele au fost tratate cu metanol timp de 15 minute la -20 °, spălate și blocate timp de 1 oră la temperatura camerei în 5% BSA/PBS. Anticorpul P65 (Cell Signaling 6956) a fost incubat peste noapte la 4 ° C și anticorpul secundar (Life Technologies) a fost aplicat timp de 1 oră la temperatura camerei. Secțiunile au fost tratate cu suport de montare DAPI și acoperite. Celulele au fost numărate folosind imaginea J pe cel puțin cinci câmpuri per grup. Toate imaginile de imunofluorescență au fost realizate cu un microscop Nikon Ti.