Secvențierea întregului genom identifică o nouă mutație genică ABCB7 pentru cerebelul congenital legat de X
Subiecte
Abstract
Introducere
Ataxii cerebeloase congenitale legate de X.
Genealogia familiei Buryat. Secvențierea întregului genom a fost efectuată pentru pacientul desemnat de o săgeată; simbolurile solide indică persoanele afectate; cercuri punctate - obligă femelele purtătoare heterozigote; simboluri deschise - indivizi neafectați; simboluri tăiate - subiecți decedați; asteriscuri - indivizi care au fost folosiți pentru genotipare. 6
Descrierea clinică
Scanările prin imagistică prin rezonanță magnetică (RMN) au evidențiat hipoplazie a emisferelor cerebeloase și a vermisului la bărbații afectați din genealogia Buryat. Simptomele neurologice frecvente pentru toți membrii familiei afectați au fost întârzierea dezvoltării, dificultăți de vorbire și coordonare, ataxia membrelor și truncale și disartria (Tabelul suplimentar 1). Pacienții examinați nu au putut să stea fără sprijin în niciun moment înainte de vârsta de 15 luni sau să meargă independent înainte de vârsta de 7 ani și să își spună primele cuvinte înainte de vârsta de 4 ani. Pentru majoritatea pacienților, s-au observat nistagmus, oftalmoplegie și reflexe crescute ale tendonului. Nu au existat semne de memorie sau tulburări cognitive la toți pacienții din acest pedigree. 6
Caracteristicile anemiei sideroblastice sau ale tulburărilor de cupru nu au fost detectate. Testele hematologice efectuate pentru pacient (III-18) cu ataxie legată de X de la pedigree Buryat nu au arătat anomalii ale celulelor eritropoietice sau acumularea de granule de fier. Valorile hemoglobinei au fost în medie de 149 g/l (interval normal, 130-180 g/l), indicele de culoare în medie 1,0 (interval normal, 0,80-1,05), testul de sedimentare a eritrocitelor în medie 3 mm/h (interval normal, 0-15 mm/h) și numărul de globule albe a fost în general normal. Toate testele biochimice au fost normale, cu excepția unui nivel ușor crescut de bilirubină, 14,5 mg/l (interval normal, 5-12 mg/l), iar analiza urinei nu a fost remarcabilă. 6
Materiale și metode
Probele de sânge ale tuturor subiecților au fost colectate anterior cu acordul informat adecvat și aceste date au fost deja raportate. 6 Nu s-a găsit nicio consanguinitate prezentă în pedigree (Figura 1). O bibliotecă genomică a fost făcută dintr-o probă de ADN de 2 μg a pacientului III-17 urmând protocolul pentru Paired-End DNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, SUA). Secvențierea genomului cu randament ridicat a fost efectuată pe platforma Illumina HiSeq 2000 cu o adâncime de acoperire de cel puțin 14 ori a genomului GRCh37. Analiza genomului a fost efectuată folosind software-ul „ngs-pipeline” proiectat de grupul nostru http://rogaevlab.ru/ngs-pipeline. Variantele rare identificate au fost trimise către NCBI ClinVar și sunt disponibile la www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?LinkName=orgtrack_clinvar&from_uid=505407.
Paternitatea a fost determinată prin analiza STR (repetare scurtă în tandem) folosind markeri STR de casă și sistemul PowerPlex 16 (Promega, Madison, WI, SUA).
Rezultate
Secvențierea întregului genom
Identificarea variantelor în ABCB7 și ATP7A gene. Reprezentarea regiunilor genomice care conțin mutații folosind instrumentele IGV (Integrative Genomics Viewer):A) exonul 16 din ABCB7 genă (hg19 chrX: g.742734204C> T),) 41,4 kb regiune ștearsă din ATP7A gena (hg19 chrX: g.77190006_77231471del), inclusiv exonul 2; săgeți verticale în (A) și () a indicat loci cromozomiali pentru ABCB7 și ATP7A gene. (c) Secvențierea verificării mutațiilor candidate în exonul 16 din ABCB7 genă. (d) Schema grundelor pentru validarea ștergerii în ATP7A genă. (e) Secvențierea validării prin Sanger secvențierea ștergerii în ATP7A genă la pacienți. (f) Produse PCR ale ATP7A regiune ștearsă de genă: M, scară ADN; R, flancul „dreapta” în amonte cu regiunea de ștergere; În, ștergere interioară a regiunii; L, flancul „stânga” în aval cu regiunea de ștergere (R, In, L - produsele sunt prezente dacă ștergerea este absentă; Del - produsul este prezent dacă există ștergerea în proba de ADN).
ABCB7 genă
Varianta de sinonim fără sinonim hg19 chrX: g.74273420C> T în exonul 16 (AF241887) de ABCB7 gena (Gene ID: 22) duce la substituirea glicinei la serină în poziția 682 a proteinei 7 a casetei de legare a ATP (NP_001258625, UniProt O75027) (Figurile 2a și c). Deoarece varianta identificată este localizată în apropierea unui site de îmbinare acceptor în cadrul primului triplet de codificare al exonului 16, am examinat dacă substituția ar putea duce la formarea unui nou sit de îmbinare puternic. Instrumentele bioinformatice care testează site-uri de îmbinare supuse pe baza frecvențelor nucleotidice în fiecare poziție a sitului (de la -20 la +3) pentru acceptori constitutivi, casete, interioare și externe nu au prezis modificări ale îmbinării alelei mutante 18, 19 (Tabelul suplimentar 5).
Există mai multe transcrieri cunoscute ale ABCB7 gena care codifică izoformele proteice, iar varianta identificată afectează toate izoformele proteice prezise. Structura și funcția domeniilor de proteine ABCB7 nu sunt pe deplin înțelese. Mutația este localizată în domeniul de legare a nucleotidelor (NBD) al proteinei ABCB7 (NP_001258625, UniProt O75027), iar întreruperea acestei regiuni în ATM1 drojdie ortolog duce la pierderea funcției proteinelor și acumularea de fier în interiorul mitocondriei (Figura suplimentară 3A ). 20 Am studiat modificările structurale ale proteinei ABCB7 care poartă varianta serină mutantă utilizând programul de bioinformatică Phyre2. 21 Analiza comparativă a