Regulamentul de feedback negativ al semnalizării antivirale mediate de RIG-I de către ISG15 indus de interferon

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

ABSTRACT

Celulele de mamifere sunt echipate cu două mașini imune înnăscute distincte care detectează infecțiile virale și declanșează inducerea interferonilor de tip I (IFN) și a citokinelor proinflamatorii (17). Acizii nucleici virali extracelulari sunt recunoscuți de receptorii de tip Toll (3, 7, 8 și 9) în endozom, în timp ce acizii nucleici intracelulari, cum ar fi ARN dublu catenar (dsRNA) și ARN 5'-trifosfat, sunt recunoscuți de către gena I inductibilă de acid retinoic (RIG-I)/proteina genei asociate diferențierii melanomului 5 (MDA5 sau Helicard) din citoplasmă (2, 11-13, 31, 34). DsRNA extracelular activează factorul de reglementare 3 NF-κB și IFN (IRF3)/IRF7 prin receptorul Toll-like 3 și proteina adaptor TRIF, iar dsRNA intracelular activează NF-κB și IRF3/IRF7 prin RIG-I și proteina adaptor mitocondrială MAVS/VISA/Cardiff/IPS-1; ambele căi induc producția IFN de tip I (1, 18, 28, 35, 40).

regulamentul

Proteina RIG-I este o ARN helicază citosolică DEXD/H cutie cu dsRNA sau proprietăți de legare a ARN-ului 5'-trifosfat (13, 31, 42). RIG-I activează producția de IFN de tip I ca răspuns la prezența unui genom de ARN viral intracelular, precum virusul Sendai sau virusul hepatitei C (38, 42) și joacă roluri centrale în reglarea producției de IFN ca răspuns la infecție virală în fibroblaste și celule convenționale dendritice (15). Răspunsul antiviral la infecția cu virusul ARN este abolit în celulele fibroblaste embrionare murine (MEF) cu deficit de RIG-I și invers, replicarea virală este restricționată în celulele care supraexprimă RIG-I (42). În plus, semnalizarea antivirală mediată de RIG-I/MDA5 poate fi perturbată de diferite proteine ​​virale derivate din virusul hepatitei C, paramixovirusurile sau virusul gripal (3, 8, 29).

Deși șoarecii cu deficit de ISG15 au fost raportați inițial că prezintă semnalizare IFN normală și rezistență la infecțiile cu virusul stomatitei veziculare (VSV) și infecțiile cu virusul choriomeningitei limfocitotice (LCMV), s-a dovedit recent că acești șoareci au o susceptibilitate crescută la gripă, herpes și infecții virale Sindbis ( 23, 30). Rolul antiviral al ISG15 a fost, de asemenea, susținut de observații că supraexprimarea ISG15 reprimă replicarea virusului Sindbis în mai multe organe ale șoarecilor cu deficit de receptor IFN-α/β și protejează gazda împotriva letalității induse de virus (22). Printre țintele celulare recent identificate ale ISG15 se numără mai multe proteine ​​antivirale induse de IFN, inclusiv PKR, MxA, HuP56 și RIG-I, sugerând că conjugarea ISG15 poate juca un rol regulator important în răspunsurile antivirale mediate de IFN (26, 43). Cu toate acestea, șoarecii cu deficiență de Ube1L care nu reușesc să producă conjugați ISG15 au prezentat semnalizare IFN-α/β normală și răspunsuri antivirale la infecțiile cu VSV și LCMV (20).

Proteina RIG-I detectează componentele virale intracelulare și inițiază un răspuns antiviral, care stimulează producția de IFN. IFN, la rândul său, activează transcrierea RIG-I, generând astfel o buclă de feedback pozitiv care duce la acumularea de proteină RIG-I în timpul răspunsului imun antiviral. În același timp, Lgp2 inductibil cu IFN interferează cu recunoașterea dsRNA de către proteina RIG-I și, prin urmare, funcționează ca un regulator negativ (33, 41, 42). Aici, raportăm o buclă suplimentară de feedback negativ care controlează nivelurile celulare ale proteinei RIG-I prin ISGilarea proteinei, care este indusă de semnale antivirale sau IFN-α/β. Aceste rezultate au dezvăluit un mecanism prin care puterea de semnalizare mediată de RIG-I poate fi reglată fin pentru a menține un echilibru între apărarea înnăscută și hipersensibilitatea în timpul răspunsurilor antivirale.

MATERIALE ȘI METODE

Plasmide. ADNc ISG15 de șoarece de lungime completă a fost obținut de la ficatul șoarecilor tratați cu LPS prin transcriptază inversă PCR (RT-PCR) și apoi clonat în siturile EcoRI/XhoI ale plasmidei pCS2-MT. Secvențele primare PCR au fost după cum urmează: 5'-CCGGAATTCGCAGCAATGGCCTGGGAC-3 'și 5'-CCGCTCGAGGGCACACTGGTCCCCTCC-3'. ADNc RIG-I uman de lungime completă a fost izolat din pEF-BOS-Flag-RIG-I (furnizat de Takashi Fujita) și subclonat în pcDNA3.1/Plasmida Hygro (Invitrogen). O mutație punctuală Flag-RIG-I (K172R) a fost introdusă cu kitul de mutageneză direcționată către site-ul QuikChange conform instrucțiunilor producătorului (Stratagene). Plasmidele pCAGGS-HA-UBE1L și pFlag-CMV-UbcM8 au fost furnizate cu amabilitate de Dong-Er Zhang (Institutul de Cercetare Scripps), iar plasmidele hemagglutinină (HA) -Ub, Flag-human ISG15 și Flag-UBP43 au fost furnizate de Chin Ha Chung (Universitatea Națională din Seul, Coreea). Plasmidele pEGFP-N (Clonetech) și pISRE-luc (Stratagene) au fost achiziționate, iar plasmida luciferază pPRDIII-I a fost furnizată cu amabilitate de Katherine A. Fitzgerald (Universitatea din Massachusetts).

Anticorpi și Western blot. Celulele au fost lizate în tampon de liză (150 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1% sodiu dodecil sulfat [SDS], 0,5% deoxicolat, 25 mM Tris-HCI, pH 7,5) conținând 1 mM ditiotreitol, 0,57 mM fenilmetilsulfonil fluor 5 μg de leupeptină/ml, 2 μg de pepstatin A/ml, 5 μg de aprotinină/ml și 1 mM benzamidină. Toate substanțele chimice au fost achiziționate de la Sigma. Lizatele celulare totale au fost analizate folosind geluri de poliacrilamidă denaturare (SDS). Anticorpi împotriva Flag (M2; Sigma), HA (Roche), Myc (Roche), actină (Santa Cruz Biotechnology), gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH; Chemicon), proteină fluorescentă verde (GFP; Santa Cruz Biotechnology) și Proteina RIG-I (R37; Immuno-Biological Laboratories Co.) a fost achiziționată, iar anticorpul RIG-I anti-uman a fost descris anterior (14). Semnalele imunoreactive au fost dezvoltate folosind reactivul Super Signal (Pierce).