Reglarea în sus a exprimării genei proteinei 3 de decuplare musculară la șoareci după o dietă bogată în grăsimi,

Abstract

OBIECTIV: Pentru a analiza impactul suplimentării cu vitamina A atât a unei diete normale cu grăsimi (NF), cât și a unei diete bogate în grăsimi (HF) și a tratamentului cu acid retinoic acut (RA) asupra expresiei proteinei de decuplare 3 (UCP3) la șoareci.

PROIECTA: Șoarecii C57BL/6J au fost hrăniți timp de 18 săptămâni cu o dietă NF sau HF (10 și, respectiv, 45% energie ca grăsime), ambele având un conținut normal de vitamina A sau un exces de vitamină A (8 mg și 320 mg retinil palmitat/kg dietă, respectiv). Greutatea corporală și aportul de energie au fost înregistrate periodic. Nivelurile de ARNm UCP3 și proteine UCP3 în mușchiul scheletic (soleus/gastrocnemius) au fost analizate, precum și nivelurile de ARNm UCP1, UCP2 și UCP3 în țesutul adipos maro intercapular (BAT) și nivelurile de ARNm UCP2, proteine UCP2 și leptină mARN în depozitele de țesut adipos alb (WAT). De asemenea, a fost evaluat efectul tratamentului RA acut (100 mg/kg/zi, 4 zile) asupra nivelurilor de ARNm UCP3 la mușchiul scheletic și BAT la șoareci RMN.

REZULTATE: Suplimentarea cu vitamina A a unei diete NF a dus la creșterea nivelului de ARNm UCP3 și proteină UCP3 în mușchi, ARNm UCP1 în BAT și ARNm UCP2 în WAT inghinal, dar nu a avut niciun impact asupra greutății corporale sau adipozității șoarecilor B6. Dieta HF a promovat obezitatea și a crescut nivelurile de ARNm UCP3 și proteine UCP3 în mușchiul scheletic și ale ARNm pentru toate cele trei UCP din BAT. Suplimentarea dietei HF cu vitamina A a avut un efect redus asupra obezității finale atinse și nu a dus la creșteri ulterioare ale ARNm muscular UCP3 și nici a ARNm BAT UCP1 peste nivelurile obținute cu dieta HF non-suplimentată. Nivelurile de ARNm de leptină adipoasă au fost reglementate în jos după suplimentarea cu vitamina A, independent de conținutul de grăsimi din dietă. Reglarea în sus a nivelului mRNA al mușchiului, dar nu și BAT, a fost găsită și după tratamentul RA acut la șoarecii RMN.

CONCLUZIE: Rezultatele oferă dovezi ale unui efect stimulator al retinoizilor asupra expresiei musculare UCP3 in vivo, și o reglare diferențială retinoidă a genei UCP3 în mușchi și BAT.

Introducere

Genele proteinei 3 (UCP3) și 2 (UCP2) de decuplare (revizuite în ref. 1) au fost clonate în 1997 ca gene care codifică proteine cu o omologie de secvență ridicată la UCP1, proteina membrana mitocondrială internă a adipocitelor brune care constituie baza moleculară termogeneză în țesutul adipos maro (BAT). Când este activ, UCP1 poate disipa energia sub formă de căldură prin decuplarea fosforilării oxidative. 1,2 Rapoarte diferite (a se vedea ref. 1) au arătat că UCP2 și UCP3 scad potențialul membranei mitocondriale atunci când sunt exprimate ectopic în drojdie și, mai recent, analiza șoarecilor knockout UCP3 a furnizat dovezi ale activității de decuplare de către UCP3 în mușchiul scheletic in vivo, 3.4, deși rezultatele sunt contradictorii. 5

În această lucrare, am studiat efectele suplimentelor cronice de vitamina A dietetice asupra expresiei UCP și asupra dezvoltării obezității induse de dietă bogată în grăsimi la șoarecii predispuși la obezitate. Ne-am concentrat asupra UCP3, deoarece posibila sa reglare de către retinoizi nu a fost abordată anterior în experimente in vivo. Suplimentarea cronică a vitaminei A a avut un efect redus asupra dezvoltării obezității induse de dietă la șoarecii predispuși la obezitate, dar rezultatele noastre arată că expresia musculară UCP3 răspunde factorilor din dietă și, în special, grăsimilor și încărcăturii cu vitamina A a dietei și dovezi reglarea diferențială a UCP3 de către retinoizi în mușchi și BAT.

Metode

Experiment de suplimentare cu vitamina A

Experiment acut de tratament RA

Șoareci masculi RMN în vârstă de 12 săptămâni (CRIFFA, Barcelona, Spania) care au fost hrăniți cu chow de laborator obișnuit (Panlab, Barcelona, Spania) și au fost menținuți la 22 ° C cu un ciclu de lumină - întuneric de 12:12 h au fost folosite. Animalele au fost aclimatizate la aproape termoneutralitate (28 ° C) timp de o săptămână înainte de a fi alocate aleatoriu la două grupuri experimentale: animale tratate cu RA, care au primit o injecție subcutanată zilnică de 100 mg/kg de all-trans-RA (Sigma, Madrid, Spania) în timpul celor 4 zile imediat înainte de a fi uciși și a controlat animalele care au fost injectate cu vehicul (ulei de măsline). Au fost efectuate două experimente independente (patru și respectiv cinci animale pe grup).

Colecția de țesuturi

Animalele au fost ucise cu CO2 urmate de luxația cervicală și decapitare, la începutul ciclului de lumină. Sângele a fost colectat din gât și s-a preparat serul. BAT interscapular (BAT), WAT inghinal (iWAT), epididimal WAT (eWAT) și retroperitoneal WAT (rWAT) au fost excizate în integritate, ponderate, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -70 ° C; mușchiul gambei (gastrocnemius/soleus) a fost de asemenea prelevat și congelat în azot lichid.

Extracția ARN și analiza Northern blot

Reactivii și sondele utilizate au fost de la Boehringer Mannheim (Barcelona, Spania). ARN tisular total a fost izolat folosind reactivul Tripure ™ și 10-20 µg au fost fracționate prin electroforeză pe gel de agaroză, transferate pe o membrană de nailon prin ștergere capilară în 20 × SSC și fixate cu lumină UV, totul conform Roca și colab. 14

ARN-urile de interes au fost analizate printr-o procedură bazată pe chemiluminiscență, utilizând sonde oligonucleotidice antisens marcate la sfârșit cu digoxigenină. 31 Au fost utilizate următoarele sonde: pentru UCP1 mARN, 5 ′ - IndexTerm GTTGGTTTTATTCGTGGTCTCCCAGCATAG-3 ′; 14 pentru ARNm UCP2, 5 ′ - IndexTerm GGCAGAGTTCATGTATCTCGTCTTGACCAC-3 ′; 14 pentru UCP3 mARN, 5 ′ - IndexTerm GACTCCTTCTTCCCTGGCGATGGTTCTGTAGG-3 ′; pentru ARNm de leptină, 5 ′ - IndexTerm GGTCTGAGGCAGGGAGCAGCTCTTGGAGAAGGC-3 ′; 32 și pentru ARNr 18S, 5 ′ - IndexTerm CGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCG-3 ′. 32

Membranele fixe au fost pre-hibridizate la 42 ° C timp de 15 minute în DIG-Easy Hyb și apoi hibridizate cu sonda oligonucleotidică corespunzătoare (34 ng/ml, cu excepția sondei ARNr 18S, care a fost utilizată la 70 pg/ml) în DIG -Usor Hyb la 42 ° C peste noapte și supus la 2 × 15 min de spălare într-o soluție de 2 × SSC/0,1% (g/v) SDS la temperatura camerei, urmat de 2 × 15 min de spălare la 0,1 × SSC/0,1% (g/v) SDS la 48 ° C. După blocare, membranele au fost incubate cu un conjugat anti-digoxigenină - fosfatază alcalină, apoi cu substratul chemiluminiscent CDP-Star ™ și, în cele din urmă, expuse la Hyperfilm ™ ECL (Amersham, Buckinghamshire, Marea Britanie). Benzile din filme au fost analizate prin fotodensitometrie cu scaner, cuantificate utilizând programul BioImage (Millipore, Bedford, MA, SUA) și normalizate folosind valorile corespunzătoare ale ARNr 18S. ARN-urile de interes au fost analizate secvențial pe aceeași membrană, după dezizolarea cu fierbere 0,1% (g/v) SDS.

Analiza Western blot

Probele de eWAT, iWAT și mușchi picior congelate au fost omogenizate în soluție salină tamponată cu fosfat (137 mM NaCI, 3 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4 și 3,5 mM KH2PO4) într-un omogenizator de teflon/sticlă. Omogenatele au fost centrifugate la 500 g timp de 10 minute la 4 ° C și conținutul total de proteine din supernatante a fost determinat prin metoda lui Bradford. 33 Proteina (50 μg) a fost fracționată prin electroforeză în gel SDS-poliacrilamidă pe geluri de poliacrilamidă 10% conform Laemmli 34 și apoi electroblotată la o membrană de nitroceluloză. Colorarea Ponceau S a furnizat dovezi vizuale pentru încărcarea corectă și transferul electroforetic al proteinelor la membrana nitrocelulozei. Blocarea și dezvoltarea imunoblotilor au fost efectuate utilizând un sistem de analiză western blot de chemiluminiscență îmbunătățit (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Marea Britanie). Anticorpii primari de iepure împotriva UCP2 și UCP3 au fost cumpărați de la Alpha Diagnostics (San Antonio, TX, SUA); specificitatea acestor anticorpi a fost confirmată anterior de Sivitz și colab. 35 de benzi din filme au fost analizate prin scaner fotodensitometrie și cuantificate folosind programul BioImage (Millipore, Bedford, MA, SUA).