Re-analiza proteomei matricei Lottia gigantea, inclusiv cuantificarea MaxQuant iBAQ și
Abstract
fundal
Deși importanța proteinelor din matricea organică biominerală și modificările lor posttranslaționale pentru biomineralizare este în general recunoscută, numărul proteomilor matriciali publicați este încă mic. Acest lucru se datorează în mare parte lipsei unei secvențe cuprinzătoare de baze de date, derivate de obicei din proiecte de secvențiere genomică. Cu toate acestea, analiza proteomică bazată pe spectrometrie de masă, care depinde în mod critic de baze de date de secvență de înaltă calitate, este un instrument foarte rapid pentru identificarea candidaților pentru proteinele funcționale ale matricei biominerale și modificările lor posttranslaționale. Identificarea acestor proteine candidate este facilitată de cuantificarea cel puțin aproximativă a proteinelor identificate, deoarece cele mai abundente pot fi, de asemenea, cei mai interesați candidați pentru analize funcționale ulterioare.
Rezultate
Recuantificarea celor identificate anterior Lottia proteinele matricei shell utilizând metoda cuantificării absolute bazate pe intensitate (iBAQ), implementată în software-ul de identificare și cuantificare MaxQuant, au arătat că doar 57 din 382 de identificări acceptate au constituit 98% din proteomul matricei identificat total. Acest grup de proteine nu conținea proteine intracelulare evidente, cum ar fi componentele cito-scheletice sau proteinele ribozomale, identificate invariabil ca fiind componente minore ale proteomilor cu matrice biominerală de mare viteză. Paisprezece dintre aceste proteine majore au fost fosforilate într-o măsură variabilă. Toți împreună am identificat 52 de situri fosfo în 20 din cele 382 de proteine acceptate cu încredere ridicată.
Concluzii
Arătăm că cuantificarea iBAQ poate fi un instrument util pentru restrângerea grupului de candidați funcționali ai proteinelor cu matrice biominerală pentru cercetări ulterioare în biologia celulară, genetică sau cercetarea materialelor. Cunoașterea modificărilor posttranslaționale în aceste proteine majore ar putea fi un plus valoros pentru proteomii publicați anterior. Acest lucru este valabil mai ales pentru fosforilare, deoarece s-a demonstrat deja că această modificare modifică procesele de mineralizare în unele cazuri.
Introducere
Genomurile recent publicate ale organismelor biomineralizante permit analiza pe bază de spectrometrie de masă cu randament ridicat a proteomilor și fosfoproteomilor biominerali, facilitând astfel identificarea rapidă a fosfoproteinelor și a siturilor de fosforilare [15, 16]. În prezentul studiu adăugăm fosfoproteomul Lottia gigantea matrice shell la cea recent publicată Lottia proteomi de coajă [17, 18]. Mai mult, am re-cuantificat Lottia proteome shell folosind metoda iBAQ (cuantificare absolută bazată pe intensitate) [19] așa cum a fost implementată în MaxQuant. Acest lucru a arătat că 57 de proteine reprezintă 98% din proteomul total identificat. Sugerăm că cuantificarea permite identificarea proteinelor majore, care sunt cei mai probabili candidați la proteinele funcționale din coajă, păstrând în același timp informații despre proteinele minore, indiferent dacă aceste proteine minore joacă sau nu un rol în mineralizare sau nu, și indiferent dacă acestea apar - sau extracristalin.
Materiale și metode
Pregătirea matricei și a fosfopeptidelor
Fosfopeptidele s-au îmbogățit prin legare reversibilă la mărgele TiO2 (Titansphere 10 μm, GL Sciences, Japonia) în urma protocoalelor stabilite [21], dar înlocuind acidul 2,5-dihidroxibenzoic în tamponul de încărcare cu 6% acid trifluoroacetic (TFA) [22]. Pe scurt, margelele au fost spălate mai întâi în 80% acetonitril conținând 0,1% TFA (tampon de spălare), apoi în 80% acetonitril care conține 6% TFA (tampon de legare). Peptidele s-au dizolvat în tampon de legare (200 ul/peptide cu matrice de 2 mg) și s-au adăugat la aproximativ 5 mg de margele de TiO2 peletate slab. Amestecul a fost incubat pe o roată rotativă timp de 45 de minute. După centrifugare, supernatantul a fost din nou incubat cu margele proaspete de TiO2 ca înainte. Margelele au fost apoi spălate de două ori cu 200 pl de tampon de legare urmat de 2 × 200 pl de tampon de spălare. În cele din urmă, bilele încărcate au fost umplute în vârfuri de etapă C8 și fosfepteptidele au fost eluate cu 2 × 100 pl dintr-o soluție conținând 40% acetonitril și 15% amoniac. Eluatul a fost uscat sub vid într-un concentrator Eppendorf la
20 μl și acidulat cu TFA. Peptidele au fost purificate pe vârfurile etapei C18 [23] după diluarea la 200 μl cu acid acetic 0,5%.
Analiza LC-MS
Probele îmbogățite cu fosfopeptide au fost analizate pe un spectrometru de masă Q Exactive de înaltă performanță Quadrupole Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania) [24] conectat la un sistem HPLC Easy-nLC 1000 nanoflow (Thermo Fisher Scientific). Peptidele au fost separate pe o coloană de 50 cm cu un diametru interior de 75 μm umplut cu margele C18 de 1,8 μm (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Germania) preparate după cum este descris [25]. Peptidele au fost eluate cu acetonitril în acid formic 0,1% folosind un gradient de 5-30% acetonitril în 95min, 30-60% în 30 min și 60-95% în 8 min la un debit de 250 nl/min și o temperatură a coloanei de 50 ° C [25]. Spectrele de masă au fost achiziționate într-o manieră dependentă de date prin comutarea automată între MS și MS/MS într-o abordare de top 10. Rezoluția a fost de 70000 pentru spectrele complete și de 17500 (ambele la m/z 200) pentru fragmentele derivate din HCD. Timpul de excludere dinamic a fost de 30 sec.