Pregătirea probei Western blot Abcam

Legate de

Preparate de probă Western blot, inclusiv tampoane de liză, lizat din cultura celulară, lizat din țesuturi și determinarea concentrației de proteine.

Conținutul protocolului de pregătire a probelor

Tampoane de liză
Inhibitori de protează și fosfatază
Prepararea lizatului din cultura celulară
Prepararea lizatului din țesuturi
Determinarea concentrației de proteine
Pregătirea probelor pentru încărcarea în geluri: denaturate și native, reduse și non-reduse

Tampoane de liză

Tampoanele de liză diferă prin capacitatea lor de a solubiliza proteinele, cu cele care conțin dodecil sulfat de sodiu (SDS) și alți detergenți ionici considerate a fi cele mai dure și, prin urmare, cele mai susceptibile de a oferi cel mai mare randament.

Considerentul principal la alegerea unui tampon de liză este dacă anticorpul ales va recunoaște probele denaturate. Atunci când acest lucru nu este cazul, va fi notat pe foaia tehnică a anticorpilor și trebuie folosite tampoane fără detergent sau cu detergenți neionici relativ ușori (NP-40, Triton X-100).

Localizarea proteinelor și alegerea tamponului de liză

Localizarea proteinelor	Se recomandă tampon
Întregă celulă	NP-40
Citoplasmatic (solubil)	Tris-HCI
Citoplasmatic (legat de cito-schelet)	Tris-Triton
Legat de membrană	NP-40 sau RIPA
Nuclear	RIPA sau utilizați protocolul de fracțiune nucleară *
Mitocondriile	RIPA sau utilizați protocolul fracției mitocondriale *

* Proteinele care se găsesc exclusiv sau predominant într-o locație subcelulară vor fi mai îmbogățite într-un lizat al fracției subcelulare în comparație cu celulele întregi sau lizatele tisulare. Acest lucru poate fi util atunci când se încearcă obținerea unui semnal pentru o proteină slab exprimată. Vă rugăm să consultați protocoalele noastre separate pentru fracționarea sub-celulară.

Rețete tampon Lysis:

150 mM clorură de sodiu
1,0% NP-40 (Triton X-100 poate fi substituit cu NP-40)
50 mM Tris pH 8,0

Acesta este un tampon popular pentru studiul proteinelor care sunt citoplasmatice sau legate de membrană sau pentru extracte de celule întregi. Dacă există îngrijorarea că proteina de interes nu este extrasă complet din material insolubil sau agregate, tamponul RIPA poate fi mai potrivit deoarece conține detergenți ionici care vor aduce mai ușor proteinele în soluție.

Tampon RIPA (tampon de test radioimunoprecipitare)

150 mM clorură de sodiu
1,0% NP-40 sau Triton X-100
0,5% deoxicolat de sodiu *
0,1% SDS (dodecil sulfat de sodiu)
50 mM Tris, pH 8,0

* Poate fi preparat ca o soluție stoc de 10%, care trebuie protejată de lumină.

Tamponul RIPA este util pentru extracte de celule întregi și proteine legate de membrană și poate fi preferabil tampoanelor NP-40 sau Triton X-100 numai pentru extragerea proteinelor nucleare. Va perturba interacțiunile proteină-proteină și, prin urmare, poate fi problematică pentru imunoprecipitații și analize de tip pull-down.

În cazurile în care este important să se păstreze interacțiunile proteină-proteină sau să se minimizeze denaturarea, trebuie utilizat un tampon fără detergenți ionici (de exemplu SDS) și, în mod ideal, fără detergenți neionici (de exemplu, Triton X-100).

Liza celulară cu tampon fără detergent se realizează prin forfecare mecanică, adesea cu un omogenizator Dounce sau prin trecerea celulelor printr-un tip de seringă. În aceste cazuri, un tampon Tris simplu va fi suficient, dar așa cum s-a menționat mai sus, sunt necesare tampoane cu detergenți pentru a elibera proteinele legate de membrană sau citoschelet.

Tampon Tris-Triton (proteine cito-scheletice)

10 mM Tris, pH 7,4
100 mM NaCI
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1% Triton X-100
10% glicerol
0,1% SDS
0,5% deoxicolat

Toate aceste patru tampoane se vor menține la 4 ° C timp de câteva săptămâni sau până la un an dacă sunt împărțite în alicote și depozitate la -20 ° C.

Inhibitori de protează și fosfatază

De îndată ce apare liza, începe proteoliza, defosforilarea și denaturarea. Aceste evenimente pot fi încetinite semnificativ dacă eșantioanele sunt păstrate pe gheață sau la 4 ° C în orice moment și se adaugă inhibitori adecvați în tamponul de liză.

Sunt disponibile cocteiluri gata de utilizare de inhibitori de la diverși furnizori, dar vă puteți crea propriul cocktail.

Inhibitor	Protează / fosfatază inhibat	Concentrația finală în tamponul de liză	Stoc (magazin la -20 ° C)
Aprotinin	Tripsină, chimotripsină, plasmină	2 μg/ml	Se diluează în apă, 10 mg/ml. Nu reutilizați alicote dezghețate.
Leupeptina	Lizozomal	5-10 µg/mL	Se diluează în apă. Nu reutilizați alicote dezghețate.
Pepstatin A	Proteaze aspartice	1 μg/ml	Se diluează în metanol, 1 mM.
PMSF	Serină, cisteină proteaze	1 mM	Se diluează în etanol. Puteți reutiliza aceeași alicotă.
EDTA	Metaloproteazele care necesită Mg 2+ și Mn 2+	5 mM	Se diluează în dH2O, 0,5 M. Reglați pH-ul la 8,0.
EGTA	Metaloproteazele care necesită Ca 2+	1 mM	Se diluează în dH2O, 0,5 M. Reglați pH-ul la 8,0
Fluorură de sodiu	Fosfataze serină/treonină	5-10 mM	Se diluează în apă. Nu refolosiți după dezghețare.
Sodiu ortovanadat	Tirozin fosfataze	1 mM	Se diluează în apă. Nu refolosiți după dezghețare.