Platforma de picături microfluidice pentru screening cu o singură celulă de înaltă viteză a biodiversității PNAS

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: gabibov @ mx.ibch.rusidney.altman @ yale.edu

Contribuit de Sidney Altman, 7 ianuarie 2017 (trimis spre revizuire la 15 septembrie 2016; revizuit de Robert S. Phillips și Israel Silman)

microfluidice

Figurile articolelor și SI

Cifre

Schema principală a tehnicii MDE - FACS. Compartimentarea unei biblioteci de specii cu mașini specifice de generare a fluorescenței în MDE utilizând emulsificarea în cipuri microfluidice a permis testarea cu o singură celulă a unei funcții vizate. Doar fenotipurile specifice (indicate de steaua galbenă) se potrivesc și activează mașinile în picături, ducând astfel la producerea de substanțe fluorescente. Deoarece volumul picăturilor a fost uniform, concentrații și condiții similare au dus la o distribuție îngustă a fluorescenței care a corespuns aceleiași activități. Semnalul fluorescent a fost înregistrat de un sortator de celule convențional care a separat variantele care au activat mașinile (activatori) de cele care nu au (gunoi). Speciile neculturabile au fost analizate prin secvențierea directă a MDE. Dacă activatorii selectați ar putea fi cultivați in vitro, aceștia au fost regenerați din picături, crescuți și analizați printr-o combinație de metode clasice (cinetică, LC-MS, secvențierea și altele). W/O/W, emulsie dublă apă-în-ulei-în-apă.

Screeningul biocatalizatorilor ancorati pe suprafata drojdiei folosind MDE - FACS. (A) Compartimentarea celulelor de drojdie active (RFP-pozitive) și inactive (non-fluorescente) cu substrat fluorogen. După ce amestecul de celule active și inactive a fost încapsulat, produsul fluorescent s-a acumulat numai în interiorul picăturilor cu celule active, care au fost selectate folosind FACS. (B) Vizualizarea reacției biochimice prin fuzionarea semnalelor de fluorescență verde (produs de reacție), fluorescență roșie (proteină reporter) și a imaginii luminii vizibile. (Bară de scală, 100 μm.) (C) Graficul reprezintă eficiența îmbogățirii în funcție de diluarea celulelor active cu celule inactive după o rundă de MDE - FACS. (D) Eficiența îmbogățirii MDE - FACS pentru celulele active care prezintă diferiți biocatalizatori (DNază I, EK și BChE) și celule inactive (Fab) amestecate într-un raport 1: 1: 1: 100. (E) Selectarea mutanților BChE cu diferite niveluri de activitate din biblioteca BChE înainte de selecție (Lib) și după selecție folosind porțile G1 - G3. (Inserare) Suprapunerea spectrelor de picături MDE - FACS cu Fab, biblioteca BChE și WT BChE. Sunt indicate porțile utilizate pentru sortare. Mediile ± intervalele intercuartile sunt prezentate pentru fiecare grup. P

Incapsularea celulelor microfluidice în picături MDE. (A) Emulsificare secvențială în așchii cu o singură emulsie. (B și C) Geometriile canalelor de cipuri microfluidice utilizate pentru a produce MDE. (B) Cipul de 20 μm utilizat pentru încapsularea drojdiei. (C) Cipul de 60 μm utilizat pentru încapsularea bacteriilor și drojdiei. W/O, emulsie unică apă-în-ulei; W/O/W, emulsie dublă apă-în-ulei-în-apă.