O dietă bogată în zaharoză induce mutații în cercetarea cancerului la șobolan

Abstract

INTRODUCERE

Compoziția furajelor pentru animale în cele patru grupe de doze

induce

Proteine ​​oxidate și MDA. 2

Aproximativ 0,3 g de ficat zdrobit a fost omogenizat timp de 10 s cu un omogenizator Ultra-Turrax T25 (Janke Kunkel GMBH, Staufen, Germania) în 3 ml de zaharoză 0,25 m și centrifugat la 9000 × g, iar fracția citosolică a fost obținută prin precipitare de calciu (18). Fracțiile plasmatice și citosolice din ficat au fost testate pentru reziduurile oxidate de lizină (AAS) și pentru resturile oxidate de prolină sau arginină (γ-glutamil semialdehidă) în proteine, așa cum este descris de Daneshvar și colab. (19). Proteina a fost determinată pe un analizor Cobas Mira + folosind un kit comercial (numărul de catalog 0736783; Roche, Basel, Elveția).

MDA totală în plasmă a fost determinată prin HPLC așa cum este descris de Lauridsen și Mortensen (20) .

Enzime antioxidante.

Testele automate pentru enzimele antioxidante SOD, GPx, CAT și GR în RBCs lizate au fost efectuate pe un analizor Cobas Mira. SOD (numărul de catalog Randox SD 125) și hemoglobina (numărul de catalog Randox HG 980) au fost determinate folosind kituri disponibile comercial, în timp ce activitatea GR a fost determinată prin metoda Goldberg și Spooner (21). Activitatea GPx, folosind terț-butilhidroperoxid ca inițiator și activitatea CAT au fost determinate în conformitate cu o metodă descrisă de Wheeler și colab. (22). Activitățile enzimatice din RBC au fost calculate în raport cu cantitatea de hemoglobină.

Vitamina C din plasmă și ficat.

Plasma (200 μl) și omogenizarea ficatului (300 mg) au fost tratate imediat cu acid metafosforic așa cum s-a descris anterior și depozitate timp de maximum 3 luni la -80 ° C înainte de analiza HPLC pentru ascorbat și dehidroascorbat (23) .

Izolarea celulelor din ficat și căptușeala colonică.

Izolarea celulelor hepatice s-a efectuat în esență așa cum s-a descris anterior (24). Celulele mucoasei colonice au fost răzuite de pe bucățile de colon decongelate cu o lamă de microscop de sticlă și plasate în soluție Merchant-EDTA rece [0,14 m NaCl, 1,47 mm KH2HPO4, 2,7 mm KCl, 8,1 mm Na2HPO4, 10 mm NaH2PO4 și 10 mm NaEDTA (pH 7,4); Ref. 25] .

Analiza mutației.

Celulele colonului și ale ficatului au fost suspendate în 2 ml de Merchant-EDTA prin pipetare în sus și în jos de trei ori. Aproximativ 20 de milioane de celule au fost filtrate printr-un filtru de celule (Falcon; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), iar ADN-ul a fost purificat prin trusa de izolare a ADN-ului RecoverEase (Stratagene, La Jolla, CA). ADN din aproximativ 60 mg de ficat congelat a fost preparat de către RecoverEase așa cum este descris de producător (Stratagene). Preparatul ADN (8 pl) a fost ambalat cu extract de ambalaj Transpack (Stratagene). Dacă amestecul de ambalare a fost vâscos după timpul standard de ambalare recomandat de 180 min, amestecul a fost incubat încă 60 min. Dacă amestecul a fost încă vâscos după acest timp, s-au adăugat reactivi suplimentari Transpack și amestecul a fost incubat timp de încă 60 de minute. Acest preparat de fagi a fost utilizat pentru a infecta Escherichia coli G1250 (hfl -). Fagii cu mutații la locusul cII au fost identificați prin formarea plăcii în condiții de creștere selectivă la 24 ° C, iar numărul total de fagi infecțioși a fost determinat prin formarea plăcii în condiții de creștere neselective la 37 ° C așa cum este descris (mutația λ Select-cII ™ Sistem de detectare pentru rozătoarele mari albastre; Stratagene).

Analiza SCGE.

Detectarea deteriorării ADN-ului în ficatul unic și celulele colonului a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (24). Nivelul siturilor sensibile la EndoIII a fost obținut ca diferență în scorurile de diapozitive paralele incubate cu și fără enzime EndoIII la 37 ° C timp de 45 de minute [Endoima enzima a fost un dar bun de la Serge Boiteux (UMR217 Centre National de la Recherche Scientifique et Commissariat) a l'Energie Atomique, Fontenay aux Roses, Franța)]. Un total de 50 de imagini au fost marcate pentru fiecare probă, utilizând sistemul software Kinetics Imaging Limited (Liverpool, Marea Britanie) versiunea 4 pentru a determina cantitatea de ADN care a migrat de la capul cometei la coadă.

Detectarea 8-oxodG.

Nivelurile de 8-oxodG în raport cu deoxiguanozina au fost măsurate în celulele mucoasei colonului și ficatul prin HPLC cu detectare electrochimică după izolarea și digestia ADN-ului nuclear așa cum s-a descris în altă parte (26). Concentrațiile urinare de 8-oxodG au fost măsurate prin HPLC cu detectarea spectrometriei de masă tandem așa cum s-a descris în altă parte (27) .

32 P Analiza postetichetare.

ADN-ul a fost extras din ficatul zdrobit și din celulele mucoasei colonice prin procedura standard de extracție a fenolului/cloroformului, iar testul postetichetare 32 P a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (28), folosind extracția butanolului ca procedură de îmbogățire. Un standard format din ADN timus de vițel modificat in vitro benzo (a) piren-diol-epoxid a fost folosit pentru a corecta variația de zi cu zi în test. Rezultatele sunt exprimate ca aducti/10 8 nucleotide, pe baza mediei a două teste independente.

Cuantificarea rERCC1 și rOGG1 Niveluri de ARNm în colon și ficat.

ARN-ul total a fost purificat din 10 mg de ficat sau din 5 × 106 celule de colon folosind un kit de purificare a ARN-ului total Qiagen conform recomandărilor producătorului. ARN-ul a fost tratat cu DNază după cum a recomandat Qiagen. Controlul ulterior al calității a arătat că toată contaminarea genomică a fost eliminată prin tratamentul cu DNază. Integritatea ARN-ului a fost verificată prin electroforeză pe gel așa cum s-a descris anterior (29). ARN (200 ng) a fost utilizat pentru sinteza ADNc într-un volum de reacție de 10 μl folosind kitul Taqman Gold cu transcriere inversă-PCR, așa cum este recomandat de PE Biosystems. Pentru cuantificarea nivelurilor de mARN, s-au folosit sonde Taqman. Pentru rERCC1, s-au utilizat următoarele oligonucleotide: (a) grund înainte (53F), 5'-cctgggaaggacgaggaaa-3 '; (b) grund invers (121R), 5′-tgggataacaaacttcttcctggt-3 ′; și (c) sonda Taqman (74T), 5′-FAM-cggccacagccctcaggacc-TAMRA-3 ′ (TAGCopenhagen). Pentru rOGG1, au fost utilizate următoarele oligonucleotide: (a) sonda Taqman, 5'-FAM-TCATGCCCTGGCTGGTCCAGAAG-TAMRA-3 '; (b) grund înainte, 5'-ACTTATCATGGCTTCCCAAACC-3 '; și (c) un primer invers, 5'-CAACTTCCTGAGGTGGGTCTCT-3 '. Această sondă nu este specifică șobolanului OGG1 și este probabil să detecteze atât ARNm nuclear, cât și mitocondrial OGG1 între specii.

Reacțiile PCR au fost efectuate în duplicat sau triplicat într-un sistem de detectare a secvenței ABI 7700 în reacții de 15 μl conținând 200 n m primeri, 300 n m sondă Taqman și 0,1 μl de ADNc în 1 × Mastermix (PE Biosystems). Pentru normalizare, ARNm 18S a fost cuantificat într-o reacție PCR separată utilizând un reactiv de test endogen de testare predevelopat pentru cuantificarea ARN 18S (PE Biosystems) în duplicat sau triplicat. Pentru fiecare animal, valoarea medie a cuantificărilor rERCC1 a fost împărțită la valoarea medie a cuantificărilor ARN 18S.