Monomerii p75NTR cu difuzie rapidă susțin apoptoza și colapsul conului de creștere de către liganzii neurotrofinici

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Record ORCID pentru Stefano Luin
Pentru corespondență: laura.marchetti @ unipi.its.luin @ sns.itantonino.cattaneo @ sns.it

Editat de K. Christopher Garcia, Universitatea Stanford, Stanford, CA și aprobat pe 14 august 2019 (primit pentru examinare 17 februarie 2019)

Vedeți conținut similar:

Semnificaţie

Neurotrofinele (NT) sunt factori de creștere homodimerici care prezintă roluri fundamentale în sistemul nervos. Activitatea lor provine din legarea și activarea a 3 tipuri diferite de receptori din membranele celulelor nervoase. Receptorul p75 NT (p75 NTR) a fost primul descoperit în 1986; cu toate acestea, pentru numeroasele fațete structurale și funcționale raportate până acum, mecanismele sale de activare au rămas evazive. Aici, demonstrăm că funcțiile sale pleiotropice sunt reglementate de diferite redistribuții ale receptorilor, care depind în mod crucial de NT disponibil și de compartimentul subcelular implicat, dar nu au legătură cu starea sa de oligomerizare. Studiile cu particule simple au dovedit că receptorii sunt monomeri cu un comportament de difuzie rapidă în membrană cu, cel mult, auto-interacțiuni tranzitorii pe scara de timp a milisecundelor.

Abstract

Receptorul neurotrofinei p75 (NT) (p75 NTR) joacă un rol crucial în echilibrarea deciziilor de supraviețuire versus deces în sistemul nervos. Cu toate acestea, în ciuda celor două decenii de studii structurale și biochimice, lipsește încă un model cuprinzător, acceptat pentru activarea p75 NTR de către liganzi NT. Aici, prezentăm un studiu cu o singură moleculă a membranei p75 NTR în celulele vii, demonstrând că marea majoritate a receptorilor sunt monomeri înainte și după activarea NT. Interesant este că stoichiometria și proprietățile de difuzie ale tipului NTR de tip sălbatic (wt) p75 sunt aproape identice cu cele ale unui mutant receptor lipsit de reziduuri care anterior se credea că induc oligomerizare. WT p75 NTR și mutat (mut) p75 NTR diferă prin partiționarea lor în regiunile cu membrană bogate în colesterol după stimularea factorului de creștere nervoasă (NGF): susținem că aceasta este originea capacității wt p75 NTR, dar nu a mut p75 NTR, pentru a media apoptoza indusă de NT (proNT) imatură. Ambele forme NTR p75 susțin retracția conului de creștere indusă de proNT: Arătăm că acumularea suprafeței receptorului este forța motrice pentru colapsul conului. În ansamblu, datele noastre dezvăluie activitatea multifacetică a monomerului N75 p75 și ne permit să oferim un cadru interpretativ coerent al datelor conflictuale existente în literatura de specialitate.

Aici, evaluăm direct și cantitativ starea oligomerizării p75 NTR în membrana plasmatică a celulelor vii prin intermediul microscopiei cu fluorescență cu o singură moleculă, cu o strategie minim invazivă (21, 22); aceasta se bazează pe inserarea unei etichete peptidice scurte în proteina N75 p75 și marcarea acesteia cu stoichiometrie 1: 1 (23, 24). Această metodă permite, de asemenea, imagistica receptorului cu coloranți organici mici, care, spre deosebire de punctele cuantice mai greoaie (Qdot), permite recuperarea stării oligomerice a receptorului de la intensitatea lor fluorescentă (21). Arătăm că membrana p75 NTR este în mare parte un monomer cu difuzie rapidă, indiferent de stimularea NT. Auto-interacțiunile sale sunt mult prea tranzitorii pentru a duce la di-trimerizare substanțială a receptorilor; important, ele nu depind de Cys256 sau de alte reziduuri sugerate anterior să joace un rol în oligomerizarea receptorilor. De asemenea, colectăm dovezi cu privire la motivul pentru care mutantul p75 NTR C256A nu provoacă apoptoză dependentă de NT (18), dar este funcțională pentru semnalizarea colapsului conului de creștere (20). Rezolvând această contradicție aparentă, revizuim aici funcția p75 NTR, în cadrul conceptual al unui receptor monomeric versatil.

Rezultate

Expresie, validare și fluoromarcare pe membrană a constructelor umane p75 NTR.

p75 NTR molecule unice difuzate ca monomeri în membrana celulară.

Dinamica membranei moleculelor p75 NTR din membrana celulară. (A) Expresia S6-p75 NTR reglementată de doxiciclină (doxy). Imaginile TIRF ale receptorilor p75 NTR marcați Abberior635P din celulele SK-N-BE (2) arată dependența numărului de receptori pe zonă (scară albastră) de concentrația de doxiciclină în mediu (valorile negre de mai jos). (Bara de scală, 5 μm.) (B) Imagine TIRF a S6-p75 NTR marcată cu Abberior635P; traiectoriile suprapuse sunt prezentate în albastru. (Bara de scală, 5 μm.) (C) Construcții etichetate S6. Greutatea p75 NTR este ca în Fig. 1A; mut p75 NTR poartă mutații C256A și G256I și lipsește reziduurile 221 până la 246 care cuprind domeniul O-tulpină în regiunea JM; și dim p75 NTR are resturile 213 până la 251 din porțiunea JM înlocuită cu domeniul fermoarului leucinei (LeuZIP) de la c-jun. CD, tocator; DD, domeniul morții; SP, peptidă semnal. (D) Distribuția D pentru greutatea p75 NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și dim p75 NTR (albastru). (E) Numărul de evenimente M&S din filmele cu 500 de cadre, normalizate pe zonă de membrană, pentru greutatea p75 NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și dim p75 NTR (albastru). Cutiile reprezintă SE, liniile reprezintă mediana, iar mustățile reprezintă SD. *** Construcțiile P NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și p75 NTR (albastru) slab. Pentru aceste analize au fost luate în considerare celule cu receptor de 0,18 până la 0,36 pe interval de micrometri pătrați.

Datorită naturii tranzitorii a dimerilor p75 NTR, precum și a fotoblanșării în timpul urmăririi, analiza intensității medii a traiectoriilor în celulele vii nu a putut oferi un răspuns neechivoc cu privire la stoichiometrie (SI Anexa, Fig. S5). Prin urmare, am analizat profilul de fotoblanșare a intensității etapelor păturilor izolate p75 NTR/Abberior635P în celulele fixe (casete galbene în Fig. 3A). Pentru fiecare punct, am cuantificat 1) numărul de pași de albire foto (săgeți roșii în Fig. 3B) și 2) intensitatea medie înainte de albire (IPRE; linii verzi în Fig. 3B). Ambele constituie o măsură directă a numărului de molecule dintr-un punct pentru oligomerizarea membranei receptorului (37). Marea majoritate a petelor analizate cu p75 NTR și mut p75 NTR sunt monomeri; adică afișează o etapă de albire fotovoltaică (aproximativ 77% pentru ambele specii; Fig. 3C). În schimb, constructul S6-TrkA stimulat de NGF a prezentat o proporție semnificativ mai mare de dimeri și oligomeri (26) (SI Anexa, Fig. S6A). Foarte important, majoritatea petelor NTR p75 slabe au prezentat un profil de albire în 2 pași (55%; Fig. 3C), iar monomerii au fost reduși la 35%. Numai dim p75 NTR a afișat o cantitate considerabilă de pete cu 3 și 4 pași de albire foto. Distribuțiile IPRE obținute pentru variantele NTR de 3 p75 au confirmat analiza etapei de albire (Anexa SI, Fig. S6B).

p75 NTR este predominant un monomer în membrana celulară. (A) Imagine TIRF care prezintă pete de receptori pe suprafața celulelor fixe (pătratele galbene reprezintă pete analizate; celulele analizate au avut 0,2 până la 0,5 pete pe micrometru pătrat). (Bara de scară, 1 μm.) (B) Urmele tipice ale profilului de intensitate ale unui monomer (sus), dimer (mijloc) și trimer (jos) care arată parametrii luați în calcul. IPRE (linia verde) este intensitatea medie a particulelor înainte de prima etapă de înălbire, săgețile roșii indică pași individuali de albire, iar linia gri reprezintă intensitatea fundalului. a.u., unități arbitrare. (C) Etape de albire fotolitică pe urmă pentru wt p75 NTR, mut p75 NTR și dim p75 NTR .

Subliniem că s-au detectat niște dimeri aparenți ai mut p75 NTR (aproximativ 20% din petele analizate) similar cu pt N75 NTR: Acest lucru dovedește lipsa unei relații cu reziduurile TM indicate anterior ca conducere la dimerizarea receptorilor (17). În general, experimentele noastre fac distincție între difuzivitatea monomerilor și dimerilor și contestă existența dimerilor p75 NTR stabili în membrana celulelor vii.