Modificările metilării ADN-ului legate de privarea nutrițională o analiză a populației și a genomului
Abstract
fundal
Metilarea ADN-ului a fost identificată recent ca un mediator între expunerea la foamete in utero și o serie de trăsături metabolice și psihiatrice. Cu toate acestea, analizele la nivelul genomului sunt rare, iar analizele transversale sunt împiedicate de mulți factori potențiali de confuzie. Mai mult, relațiile de cauzalitate sunt greu de identificat din cauza lipsei unor modele experimentale controlate. În studiul actual, am combinat, prin urmare, o evaluare cuprinzătoare a diferențelor de metilare a ADN-ului la nivelul genomului la persoanele expuse la marea foamete chineză in utero cu un studiu in vitro în care am privat fibroblastele de nutriție.
Metode
Am comparat diferențele de metilare a ADN-ului din sânge integral între 25 de indivizi uterini expuși la foamete și 54 de indivizi sănătoși de control utilizând platforma HumanMethylation450. In vitro, am analizat modificările metilării ADN în 10 culturi de fibroblaste care au fost private din punct de vedere nutrițional timp de 72 de ore prin reținerea serului fetal bovin.
Rezultate
Am identificat trei regiuni metilate diferențial (DMR) în patru gene (ENO2, ZNF226, CCDC51, și TMA7) care au fost legate de expunerea la foamete în ambele analize. Analiza căilor cu date atât din probe de foamete chinezești, cât și din fibroblaste a evidențiat sistemul nervos și căile de neurogeneză ca fiind cele mai afectate de lipsa nutrițională.
Concluzii
Combinația de date transversale și experimentale oferă indicații că adaptarea biologică la foamete duce la modificări ale metilării ADN la genele implicate în sistemul nervos central.
fundal
Metilarea ADN-ului este unul dintre mecanismele epigenetice care joacă un rol important în răspunsurile celulare la influențele nocive ale mediului care sunt implicate în etiologia multor boli [1]. Studiile arată că expunerea timpurie a vieții la lipsa nutrițională este asociată cu diferențe stabile de metilare a ADN-ului [2, 3]. Privarea nutrițională, în special în utero și la începutul vieții, are efecte dăunătoare asupra dezvoltării umane și crește semnificativ riscul apariției mai multor boli cronice mai târziu în viață [3,4,5,6].
Un exemplu seminal al impactului expunerii in utero la deprivarea nutrițională este studiul de cohortă asupra descendenților de la mamele care au fost însărcinate în timpul iernii foametei olandeze din timpul celui de-al doilea război mondial, care a fost intens și bine documentat, dar cu durată scurtă [7]. Acest studiu a identificat metilarea diferențiată persistentă a factorului II de creștere asemănător insulinei (IGF2), ca un factor cheie de creștere și dezvoltare umană implicat în răspunsul la foamete in uter [3]. Studiile ulterioare ale acestei cohorte au identificat modificările metilării ADN ca mediatori ai asocierii dintre foametea maternă și bolile metabolice la vârsta adultă [6, 8]. Alte diferențe epigenetice asociate cu expunerea la foamete în uter au fost legate de schizofrenie [9] și diabetul de tip 2 [10].
În timp ce foametea olandeză este foametea cea mai studiată în literatura de specialitate, marea foamete chineză (1959–1961) a fost una dintre cele mai mari foamete înregistrate în întreaga lume și a avut consecințe mai grave, ducând la aproximativ 30 de milioane de decese [11]. Descendenții acelor mame care au suferit foamete au avut o lungime mai scurtă [5], au avut o sănătate a vieții mijlocii mai proastă [12] și au avut o rată mai mare de boli cronice [13, 14]. Studiile au arătat, de asemenea, un risc crescut de două ori de a dezvolta schizofrenie la descendenții concepuți la apogeul foametei [15, 16]. Cu toate acestea, la populația chineză a foametei a fost raportat un singur studiu de metilare a ADN la nivelul întregului genom [17]. Pentru a înțelege în continuare impactul foametei materne asupra modificărilor de metilare a ADN la descendenți, am comparat metilarea ADN-ului la nivelul genomului din sângele integral al participanților chinezi expuși la foamete în primul trimestru cu controalele neexpuse de la aceleași populații.
Deoarece un studiu transversal bazat pe populație este supus unei confuzii reziduale și nu permite examinarea efectului direct al privării nutriționale, am efectuat ulterior un studiu in vitro al fibroblastelor umane înainte și după expunerea la deprivarea nutrițională. Combinând rezultatul unei abordări de metilare la nivelul genomului a ambelor studii, ne propunem să oferim o investigație imparțială a modificărilor de metilare a ADN-ului induse de lipsa nutrițională.
Metode
Mostră de foamete chineză
Eșantionul de foamete chineză face parte din studiul nostru anterior și a fost descris mai detaliat în altă parte [9]. Pe scurt, voluntarii au fost recrutați în provincia nordică Jilin, China. Având în vedere penetrarea aproape completă a foametei în ianuarie 1960 și septembrie 1961, se presupune că cei născuți în acea perioadă vor fi expuși. Au fost incluși un total de 79 de participanți sănătoși, dintre care 25 au fost expuși la foamete în primele 3 luni in utero. Toți participanții au acordat consimțământul scris în scris. Tabelul 1 oferă detaliile complete ale participanților.
Studiul fibroblastului in vitro
Experimentul in vitro cu fibroblaste a fost descris mai detaliat anterior [9]. Pe scurt, fibroblastele au fost obținute prin biopsii cutanate de la cinci participanți sănătoși de origine olandeză, dintre care unul era de sex masculin și patru de sex feminin (vârsta medie = 38,4 ani, sd = 7,0) (vezi Tabelul 1). Toți participanții au acordat consimțământul scris în scris. Fibroblastele au fost placate în două flacoane T25 în mediu minim esențial (MEM) (Gibco®) cu 15% ser fetal bovin (FBS) (Gibco®) și 1% penicilină-streptomicină PenStrep (Gibco®) și într-o atmosferă de 95% atmosferică aer și 5% CO2 la 37 ° C (condiții normale). După atingerea confluenței de 70-80%, supernatantul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (Reactivi BioWhittaker®, Lonza). Apoi, unul dintre baloanele T25 de la fiecare donator a fost cultivat în stare fără foamete cu mediu minim esențial (MEM) (Gibco®) susținut cu 15% FBS, în timp ce celelalte baloane T25 au fost cultivate numai în mediu minim esențial (MEM) ca stare de foamete. După 72 de ore, celulele au fost recoltate din fiecare balon și depozitate sub formă de pelete de celule pentru izolarea ADN-ului.
Prelucrarea ADN-ului
ADN-ul din probele de foamete din China a fost extras din sângele integral folosind trusa Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA, SUA). Peletele de celule de fibroblaste au fost utilizate pentru izolarea ADN conform instrucțiunilor producătorului (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația și calitatea ADN-ului au fost examinate folosind NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, SUA). Conversia bisulfitului fiecărei probe de ADN a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului din kitul Zymo EZ DNA Methylation ™ (Zymo, Irvine, CA, SUA). Calitatea și cantitatea de ADN monocatenar tratat cu bisulfit au fost examinate folosind NanoDrop.
Analiza la nivelul genomului a metilării ADN-ului
Controlul calității pentru fibroblaste a fost efectuat într-un flux de lucru similar cu cel al probelor de foamete chinezești, dar a fost ajustat la noul beadchip EPIC de metilare. Setul de date a fost pre-procesat în versiunea R 3.3.1 cu pachetul meffil [22] utilizând normalizarea funcțională [23] pentru a reduce diferențele non-biologice dintre sonde. Pentru a ține cont de variabilele tehnice de lot, pre-procesarea a fost efectuată într-un set de date mai mare ( = 80), incluzând probe de ADN din alte studii care au inclus ADN din creier și sânge. Cu toate acestea, normalizarea a fost efectuată numai pentru probele de fibroblasti. Nu au existat nepotriviri între sexul prezis de metilare și sexul real și nici nu au existat probe cu valori anterioare pe canalele metilate și nemetilate. Sondele au fost eliminate dacă nu au reușit controlul calității (o detectare valoare> 0,01 pentru> 10% din probe ( = 4610) sau un număr de mărgele 10% din probe ( = 68)), au fost nespecifice [20] sau au fost una dintre sondele SNP incluse în matrice în scopuri de control al calității. Toate cele 10 probe de ADN de fibroblaste au supraviețuit controlului calității și 862.160 de sonde au fost lăsate în setul de date pentru analize ulterioare.