MicroRNA2911 atipic codificat cu caprifoi vizează direct virusul gripei A Research Cell

Subiecte

Abstract

Introducere

Virusurile gripale A (IAV) reprezintă o amenințare substanțială pentru sănătatea publică la nivel mondial. În secolul trecut, au existat trei mari pandemii de gripă care au cauzat niveluri ridicate de mortalitate, inclusiv cea mai gravă pandemie din istoria înregistrată, gripa spaniolă din 1918, care a fost responsabilă pentru peste 50 de milioane de decese umane 1,2. Subtipul H5N1 extrem de patogen și subtipul H7N9 raportat recent au arătat potențialul de a provoca noi pandemii de gripă umană 3,4,5. Mutabilitatea ridicată a IAV-urilor patogene le permite să devină rezistente la diferite tratamente preventive, inclusiv vaccinuri și anticorpi 6. Caprifoi (HS, Lonicera japonica), o cunoscută plantă chineză, a fost folosită pentru tratarea eficientă a infecției gripale de mii de ani. Mai multe rapoarte au arătat că decoctul HS poate suprima replicarea virusului gripal 7.8. Cu toate acestea, compușii activi din decoctul HS și mecanismul prin care blochează replicarea virală au rămas neclare.

Pe de altă parte, studiul nostru anterior a arătat că MIR168a derivat din plante alimentare poate trece prin tractul gastrointestinal (GI) și poate intra în circulație și în diferite organe ale șoarecilor. În ficatul de șoarece, planta MIR168a vizează proteina adaptor 1 a receptorului de lipoproteine cu densitate mică (LDL) (LDLRAP1), ceea ce duce la creșterea nivelului de colesterol LDL în plasmă 9. Acest studiu a deschis o cale de explorare a funcției fiziologice a microARN-urilor de plante exogene (miARN) la om și animale. Cu toate acestea, implicațiile reglementării regnului încrucișat mediate de miARN de plante și mecanismele responsabile de absorbția și transferul miARN de plante rămân în mare parte necunoscute, subliniind necesitatea unor investigații suplimentare. Având în vedere că pacienții cu infecție gripală au fost administrați în mod tradițional cu decoct HS, presupunem că miARN de plante din decoct HS este capabil să pătrundă în corpul uman prin tractul GI pentru a exercita un efect terapeutic. În prezentul studiu, am arătat că un miARN de plante îmbogățit în decoct HS, numit MIR2911, vizează direct diferite subtipuri de gripă A atât in vitro și in vivo.

Rezultate

Planta MIR2911 este absorbită și livrată în plămâni la șoareci după administrarea decoctului HS sau MIR2911 sintetic

Absorbția a fost evaluată la șoareci cărora li s-au administrat 500 μl de decoct HS (concentrație MIR2911: ± 0,12 pmol/ml) prin hrănire cu un singur gavaj. Concentrația bazală de MIR2911 în plasma de șoarece a fost de 242,0 ± 23,8 fM; concentrația plasmatică a MIR2911 a crescut la 517,1 ± 133,6 fM la 3 ore, a atins un vârf de 1189,2 ± 323,1 fM la 6 ore și a scăzut la 923,0 ± 189,3 fM la 12 ore după administrarea decoctului HS (Figura 1E). Figura 1F a arătat că nivelul MIR2911 din plămânii de șoarece a crescut continuu, a atins un nivel maxim la 6 ore și a scăzut la nivelul bazal la 12 ore după administrare. Cea mai mare parte a MIR2911 din sângele periferic al șoarecilor a fost detectată în fracțiunea care conține microvesicule derivate din celule (MV) (informații suplimentare, Figura S3A), ceea ce înseamnă că MIR2911 din decoctul HS ar putea fi inițial preluat din tractul GI, reambalat în MV de celulele epiteliale intestinale și în cele din urmă secretate în circulație. Datele de imunoprecipitare au arătat că majoritatea MIR2911 din MV derivate din sângele periferic al șoarecelui a fost asociată cu complexul Argonaute 2 (AGO2) (Informații suplimentare, Figura S3B).

MIR2911 de plante se leagă direct de unele tipuri de IAV și inhibă expresia proteinelor PB2 și NS1 codificate de virusul H1N1, precum și replicarea virală H1N1 in vitro

MIR2911 de plante salvează pierderea în greutate indusă de inocularea virusului și inhibă replicarea virală la șoarecii inoculați H1N1

Efectul antiviral al decoctului HS și al MIR2911 a fost testat în continuare la șoareci infectați cu H1N1. În acest experiment, șoarecilor femele BALB/c de 6 săptămâni li s-a administrat MIR2911 sintetic (0,1 nmol pe zi) prin gavaj sau li s-a permis să bea decoct HS cu o zi înainte de a fi inoculați cu virusul EID50 H1N1. După inocularea virusului, șoarecii au fost tratați continuu cu decoct MIR2911 sau HS timp de 7 zile. Așa cum se arată în Figura 3A, șoarecii infectați cu H1N1 singuri sau co-tratați cu H1N1 și ncRNA au pierdut rapid ± 20% din greutatea lor în ziua 7. În schimb, atât administrarea de MIR2911 sintetic, cât și consumul continuu de decoct HS au prevenit în mod eficient pierderea în greutate (6 EID50), în care siturile de legare MIR2911 din genele PB2 și NS1 au fost mutate fără a schimba secvențele de aminoacizi (informații suplimentare, Figura S6), a fost utilizată pentru infectarea șoarecilor. Așa cum se arată în Figura 3D și 3E, mutantul H1N1 a cauzat, de asemenea, pierderea în greutate și a avut un titru viral ridicat similar cu cel al H1N1 de tip sălbatic. În schimb, nici MIR2911 sintetic, nici decoctul HS nu au avut efecte asupra pierderii în greutate și asupra titlului de virus la șoarecii infectați cu H1N1 mutant (Figura 3D-3F).

MIR2911 de plante inhibă replicarea virală H5N1 și H7N9 in vitro și in vivo și salvează mortalitatea indusă de inoculare H5N1

Au fost de asemenea testate efectele inhibitoare ale decoctului sintetic MIR2911 și HS asupra virusului gripal H7N9 raportat recent. A/Anhui/1/2013 (H7N9), izolat anterior de un pacient din China 5, a fost utilizat în următoarele experimente. Așa cum se arată în Figura 4G și 4H, replicarea virusului H7N9 în celulele MDCK infectate a fost puternic suprimată de MIR2911 sintetic sau ARN total extras din decoctul HS (valoarea log a TCID50/ml pentru MIR2911 sintetic a fost redusă de la 3,86 ± 0,16 la 2,80 ± 0,25 la 12 ore și de la 6,02 ± 0,17 la 5,13 ± 0,16 la 24 de ore după transfecție, valoarea log a TCID50/ml pentru ARN total extras din decoctul HS a fost redusă de la 4,17 ± 0,08 la 2,99 ± 0,38 la 12 ore și de la 6,24 ± 0,04 până la 5,49 ± 0,15 la 24 de ore după transfecție). Efectul inhibitor al ARN-ului total decoct HS a fost din nou abolit prin co-transfecție cu antagomirul anti-MIR2911 (Figura 4H). Au fost de asemenea evaluate efectele decoctului sintetic MIR2911 sau HS asupra pierderii în greutate la șoarecii infectați cu H7N9. Așa cum se arată în Figura 4I, șoarecii tratați numai cu virus sau H7N9 plus ncRNA au prezentat o pierdere în greutate de aproape 30% sau respectiv 20%, în ziua 8 după infecție. MIR2911 sintetic a prevenit parțial pierderea în greutate indusă de H7N9 (

Discuţie

În medicina tradițională chineză, ierburile sunt fierte în general timp de câteva ore pentru a pregăti decoctul. Se crede în mod obișnuit că ARN-ul va fi distrus în timpul acestui proces. Într-adevăr, datele noastre au arătat că majoritatea miARN-urilor (de exemplu, MIR166g și MIR2914) îmbogățite în HS au fost degradate în timpul procesului de fierbere. Cu toate acestea, un miARN special, MIR2911, sa dovedit a fi în mare parte intact în decoctul HS final. MIR2911, raportat anterior ca miARN de plantă în Populus euphratica, Nicotiana tabacum și Helianthus annuus 15,16,17, este un miARN atipic deoarece este derivat din ARN ribozomal (ARNr) și nu urmează biogeneza clasică a miARN 18,19,20. Deși mecanismul care stă la baza stabilității ridicate a MIR2911 în timpul procesului de fierbere rămâne necunoscut, datele noastre indică faptul că o secvență unică și un conținut ridicat de GC pot contribui la stabilitatea acesteia. Rezistența MIR2911 la procesul de fierbere sau chiar tratamentul cu RNase a fost abolită după ce secvența a fost modificată și conținutul de GC a fost scăzut. Rezultatele arată că miARN poate fi o componentă importantă, potențial eficientă, dar nerecunoscută anterior în ierburile chinezești.