Melastatina potențială a receptorului tranzitoriu al canalului epitelial Mg2 6 este reglementată de Mg2 dietetic

Abstract

Mg 2+ este al doilea cation intracelular cel mai abundent și joacă un rol esențial ca co-factor în multe reacții enzimatice (1). Homeostazia Mg 2+ depinde de echilibrul dintre absorbția intestinală, excreția renală și schimbul cu osul (2). Reglarea echilibrului total al corpului Mg 2+ se află în principal în rinichi, care se potrivește strâns cu absorbția intestinală a Mg 2+. Aproximativ 80% din totalul plasmatic Mg 2+ este filtrat în glomeruli (3,4), majoritatea fiind apoi reabsorbită de-a lungul nefronului (5). Optzeci și cinci la sută din Mg 2+ filtrat este reabsorbit pasiv în tubul proximal și membrul ascendent gros al lui Henle (TAL). Tubulul distal convoluit (DCT) reabsorbe 5-10% din Mg 2+ filtrat, iar rata de reabsorbție în acest segment definește concentrația urinară finală de Mg 2+. Transportul Mg 2+ în DCT este de natură transcelulară și este influențat de restricția dietetică Mg 2+ și de un număr de hormoni (6,7). Cu toate acestea, detaliile moleculare și reglarea acestei căi rămân în mare parte necunoscute (5,6,8,9).

Tulburările ereditare cu hipomagneziemie primară au facilitat foarte mult identificarea transportorilor de ioni epiteliali în rinichi. De exemplu, elucidarea bazei genetice a hipomagnezemiei dominante izolate și a hipomagnezemiei cu hipocalcemie secundară a dus la identificarea subunității γ a Na +, K + -ATPazei și a receptorului tranzitoriu epitelial Mg 2+ melastatin 6 (TRPM6), respectiv (10-12). TRPM6, care este membru al superfamiliei TRP, este localizat de-a lungul membranei apicale a DCT. Expresia heterologă în rinichiul embrionar uman 293 celule ale TRPM6, dar nu și TRPM6 mutanți identificați la pacienții cu hipomagnezemie cu hipocalcemie secundară induce un canal cationic permeabil Mg 2+ care este strâns reglat de concentrația intracelulară de Mg 2+ (13). TRPM6 prezintă cea mai mare omologie cu TRPM7, care a fost identificat ca un canal ionic permeabil la Mg 2+, care este necesar în primul rând pentru homeostazia celulară Mg 2+ (13-15).

În analogie cu absorbția activă de Ca 2+ (re) absorbție în partea distală a nefronului și a intestinului subțire prin canalele epiteliale de Ca 2+ (receptor tranzitoriu potențial vaniloid 5 [TRPV5] și TRPV6) (16), procesul de Mg transcelular Transportul 2+ este prevăzut de următorii pași secvențiali. Condus de un potențial transmembranar favorabil, Mg 2+ intră în celula epitelială prin canalul epitelial apical Mg 2+ TRPM6. Apoi, Mg 2+ se va difuza prin citosol pentru a fi extrudat activ pe membrana basolaterală (13). Identitatea moleculară a acestor din urmă transportori Mg 2+ nu este cunoscută. Majoritatea studiilor fiziologice favorizează un mecanism de schimb dependent de Na + (17). Intrarea Mg 2+ pare a fi etapa de limitare a ratei și locul reglementării.

Scopul studiului nostru a fost de a determina locurile de absorbție activă a Mg 2+ la șoareci prin investigarea profilului de expresie al TRPM6. În plus, am stabilit dacă TRPM6 este reglementat de conținutul dietetic de Mg 2+ și de hormonii calciotropi 17β-estradiol (17β-E2), 1,25-dihidroxivitamină D3 (1,25 (OH) 2D3) și hormon paratiroidian (PTH) . Efectul conținutului de Mg 2+ din dietă a fost studiat prin analiza reglării TRPM6 la nivelurile de mARN și proteine și de excreție și niveluri serice de Mg 2+ la șoarecii C57BL6 hrăniți cu diete deficiente, normale și îmbogățite cu Mg 2+.

Materiale și metode

Studii pe animale

Pentru a evalua expresia mRNA TRPM6, TRPM7 și TRPV6 în diferite țesuturi, am construit un panou de ADNc. În acest scop, patru șoareci C57BL6 hrăniți cu o dietă completă care conținea 0,2% Mg 2+ (greutate/greutate; SSNIFF spezialdiäten GmbH, Soest, Germania) au fost uciși; s-au colectat rinichi, splină, creier, inimă, mușchi scheletic, ficat, plămân, stomac, os, duoden, jejun, ileon, cec și colon; iar ARN-ul total a fost izolat. Pentru a studia efectul conținutului dietetic de Mg 2+ asupra expresiei TRPM6 și TRPM7 la rinichi și colon, am hrănit șoareci C57BL6 (vârsta de 12 săptămâni) pentru o dietă de 10 da Mg 2+ (0,005% greutate/greutate Mg) și Mg 2+ -dieta normală (0,19% greutate/greutate Mg) sau o dietă îmbogățită cu 2+ Mg (0,48% greutate/greutate Mg; SSNIFF spezialdiäten GmbH). În ultimele 24 de ore de tratament dietetic, animalele au fost adăpostite în cuști metabolice și s-a colectat urină de 24 de ore. La sfârșitul tratamentului dietetic, au fost prelevate probe de sânge și animale au fost ucise. Țesuturile de rinichi și colon au fost prelevate și congelate imediat în azot lichid.

Efectul 17β-E2 asupra nivelului de expresie al ARNm renal TRPM6 a fost evaluat de șobolani bilaterali, ovariectomizați (OVX) și OVX care au primit 2 × 500 μg 17β-E2/d așa cum s-a descris anterior (18). Efectul PTH a fost studiat de șobolani acționați simul, paratiroidectomizați (PTX) și PTX care au primit 6 unități/zi de PTH bovină așa cum s-a descris anterior (19). În plus, efectul 1,25 (OH) 2D3 a fost studiat de șoareci 1α-hidroxilază knockout (1α-OHază -/-), șoareci heterozigoți (1α-OHază +/−) care sunt fenotip identici cu șoarecii de tip sălbatic, și șoarecii 1α-OHază -/- suplimentați intraperitoneal cu 1,25 (OH) 2D3 așa cum s-a descris anterior (20). Consiliul de etică a animalelor de la Universitatea Radboud din Nijmegen a aprobat toate procedurile experimentale.

Analiza PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost extras din rinichi, segmente complete ale intestinului și din celelalte țesuturi folosind TriZol Total ARN Isolation Reagent (Life Technologies BRL, Breda, Olanda) conform protocolului producătorului. ARN-ul obținut a fost supus tratamentului cu DNază (Promega, Madison, WI) pentru a preveni contaminarea ADN genomic. Ulterior, 2 μg de ARN au fost transcrise invers de către virusul leucemiei moloni-murine-transcriptază inversă (Invitrogen) așa cum a fost descris anterior (21). ADNc a fost utilizat pentru a determina nivelurile de expresie a ARNm TRPM6, TRPM7 și TRPV6, precum și nivelurile de ARNm ale genei menajere hipoxantină-guanină fosforibosil transferază (HPRT) ca un control endogen. Nivelurile de expresie ale ARNm au fost cuantificate prin PCR în timp real pe un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7700 (PE Biosystems, Rotkreuz, Elveția). Grundele și sondele care vizează genele de interes au fost proiectate folosind programul de calculator Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) și sunt enumerate în Tabelul 1.

Secvențe ale primerilor și sondelor Taqman pentru PCR cantitativă în timp real

În Vivo 45 Ca 2+ Test de absorbție

Absorbția intestinală a Ca 2+ a fost evaluată în două grupuri de șoareci C57BL6 prin măsurarea cantității de 45 Ca 2+ în ser la punctele timpurii timpurii după gavaj oral (15 μl/g corp greutate). Șoarecii au postit 12 ore înainte de test. Animalele au fost hemodinamic stabile sub anestezie în timpul experimentului. Soluția utilizată pentru măsurarea absorbției de Ca2+ conținea 0,1 mM CaCl2, 125 mM NaCl, 17 mM Tris (pH 7,4) și 1,8 g/L fructoză și a fost îmbogățită cu 20 μCi 45 CaCl2/ml (18 Ci/g; New England Nuclear, Newton, MA). Un grup a primit soluția 45 Ca2+ suplimentată cu MgCl2 la o concentrație finală de 10 mM, în timp ce soluția 45 Ca2+ din grupa 2 nu a fost suplimentată cu MgCl2. Probele de sânge au fost obținute la diferite intervale de timp (2, 4, 8 și 12 min). Radioactiv 45 Ca 2+ a fost analizat în ser (10 μl) prin numărare de scintilație lichidă. Modificarea concentrației serice de Ca 2+ a fost calculată din conținutul de 45 Ca 2+ al probelor de ser și activitatea specifică a Ca 2 administrat+ .

Proceduri analitice

Serul Mg 2+ și Ca 2+ au fost măsurate folosind un kit de testare colorimetrică conform protocolului producătorului (Roche Diagnostics, Woerden, Olanda). Excreția urinară de Mg 2+ și Ca 2+ a fost determinată prin spectrofotometrie de absorbție atomică pe un Perkin Elmer AAnalyst 300 (Perkin Elmer, Milano, Italia).