Insulina activează RSK (p90 ribozomal S6 kinază) pentru a declanșa un nou ciclu de feedback negativ care
Nicolas Smadja-Lamère
De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,
Michael Shum
De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,
Paul Déléris
§ Institutul de Cercetare în Imunologie și Cancer (IRIC) și
Philippe P. Roux
§ Institutul de Cercetare în Imunologie și Cancer (IRIC) și
¶ Departamentul de patologie și biologie celulară, Facultatea de Medicină, Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec H3C 3J7, Canada și
Jun-Ichi Abe
Centrul Medical ‖ Universitatea din Rochester, ACVRI, New York 14642
André Marette
De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,
Abstract
Introducere
Aici, descriem o nouă buclă de feedback negativ prin care insulina activează RSK, care promovează fosforilarea IRS-1 pe Ser-1101, independent de calea mTOR/S6K1. La rândul său, aceasta restricționează semnalizarea insulinei și metabolismul glucozei în mușchii scheletici și celulele hepatice.
PROCEDURI EXPERIMENTALE
Reactivi și anticorpi
DMSO, gelatina de pește și rapamicina provin de la Sigma-Aldrich. BI-D1870 provine din complexul MSI/WTB de la Universitatea din Dundee, Marea Britanie. PF-4708671 era de la Symansis (Timaru, NZ). Insulina a fost de la Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). Anticorpii anti-IRS1, anti-G6Pase, anti-PGC1α și anti-RSK provin de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-phospho-RSK Ser-221 și Ser-380 provin de la Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfo-IRS-1 Ser-1101 și Ser-636/9; anti-phospho-S6K1 Thr-389, anti-phospho-GSK3 Ser-21/9, anti-GSK3, anti-phospho-Foxo Ser-256, anti-Foxo, anti-phospho-mtor Ser- 2448 și anti-AKT Ser-473 provin de la Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Antitubulina a fost de la Sigma-Aldrich. Anticorpul p85 a fost de la Millipore (San Francisco, CA). Anti-PEPCK a fost de la Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Adenovirusurile dominante RSK1 (RSK1-DN) și LacZ au fost deja descrise (22).
Cultură de celule
Mioblastele L6 au fost crescute în α-MEM (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS și diferențiate în miotuburi în α-MEM cu 2% FBS așa cum s-a descris anterior (27). Celulele HepG2 au fost crescute în DMEM (Invitrogen). Celulele L6 și HepG2 au fost private de ser timp de 4 ore înainte de experiment și s-a utilizat insulină de 100 nm pentru a stimula celulele în ultima oră de privare. Hepatocitele FAO au fost menținute în mediile RPMI (Invitrogen). Celulele FAO au fost lipsite de ser peste noapte și stimulate cu concentrația indicată de insulină.
Analize occidentale
Western blot au fost efectuate așa cum este descris (23). Pe scurt, cantități egale de proteine au fost separate prin SDS-PAGE (9%) și transferate pe membrane de nitroceluloză. Membranele au fost blocate în gelatină de pește 5% diluată în PBS, pH 7,4, 0,1% Tween (PBS-T) și incubate peste noapte cu anticorpii respectivi diluați în 1% gelatină de pește în PBS-T. Imunoprecipitările au fost efectuate așa cum s-a descris cu modificări minore (24). Lizatele celulare totale (500 μg) au fost pre-curățate cu proteina A-Sepharose și imunoprecipitate cu anticorpii relevanți cuplați cu proteina A-Sepharose.
2-Deoxiglucoză (2-DG)
Au fost utilizate procedurile de absorbție 2-DG așa cum s-a descris anterior (25). Pe scurt, celulele au fost incubate timp de 8 minute în soluție salină tamponată HEPES conținând 10 μm 2-DG nemarcat și 10 μm d -2-deoxi- [3H] glucoză (0,5 μCi/ml). Reacția a fost terminată prin spălare de trei ori cu NaCl răcit cu gheață 0,9% (g/v). Radioactivitatea asociată celulei a fost determinată prin lizarea celulelor cu 0,05 N NaOH, urmată de numărarea scintilației lichide și normalizată la concentrația de proteine.
Analize ale proteinelor fosfotransferazei
Producția de glucoză
Celulele FAO au fost incubate timp de 16 ore în mediu fără ser, cu sau fără insulină (100 n m). Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS și incubate cu mediu DMEM fără fenol și glucoză suplimentat cu 20 m m l-lactat de sodiu și 2 m m piruvat de sodiu timp de 5 ore cu sau fără insulină. Supernatanții celulari au fost colectați și concentrația de glucoză a fost măsurată cu setul de testare Amplex-Red Glucose în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Invitrogen). Celulele au fost lizate cu 50 m m NaOH și concentrația de proteine a fost determinată folosind un kit de testare a proteinei BCA pentru a normaliza producția de glucoză.
Cuantificare și analize statistice
Western blot a fost cuantificat cu versiunea software Quantity One 4.6.9 (Bio-Rad). ANOVA unidirecțional cu Boneferonni sau Tuckey post-hoc și testele t au fost efectuate cu GraphPad Prism versiunea 5.0a pentru Mac (Software GraphPad).
REZULTATE
O kinază insensibilă la rapamicină fosforilează IRS-1 la concentrații normale de AA
Așa cum s-a arătat anterior (4), insulina stimulează fosforilarea IRS-1, în principal printr-o kinază sensibilă la rapamicină în condiții de supraîncărcare a nutrienților, cum ar fi un exces de AA (vezi schimbarea moleculară IRS-1 prevenită de rapamicină în condiții de 2 × AA, Fig. 1 A). Cu toate acestea, la concentrații scăzute până la normale de aminoacizi (0-1 × AA), rapamicina a avut doar efecte minore asupra deplasării moleculare superioare induse de insulină a IRS-1, sugerând că mTORC1/S6K1 nu este responsabil pentru deplasarea mobilității. Aceste rezultate indică, de asemenea, că alte kinaze ar putea fosforila IRS-1 în absența supraîncărcării AA (vezi condițiile 0-1 × AA, Fig. 1 A). Pe aceeași linie, fosforilarea RSK nu este afectată de concentrații diferite de aminoacizi sau rapamicină (Fig. 1 A).
RSK1 fosforilează IRS-1 pe Ser-1101
La analiza secvenței de aminoacizi a IRS-1, am observat că mediul peptidic din jurul Ser-1101 este conservat pe tot parcursul evoluției și corespunde motivului de tip 1 de fosforilare prezent în multe substraturi RSK (RXRXX-pS/T-XXX, vezi legenda figurii pentru detalii; Fig. 1, B și C). Am căutat apoi în secvența IRS-1 umană prezența acestui motiv consens și am găsit 5 resturi de serină supuse IRS-1 prezente în motivul fosforilării RSK (Fig. 1 D).