Insuficiența alimentară folică și suplimentarea cu acid folic afectează în mod similar metabolismul și

Abstract

Introducere

Având în vedere variabilitatea genetică în cadrul populației umane, stilurile de viață divergente, dietele foarte variabile și auto-raportarea inexactă, legăturile neechivoce între dieta și predispoziția bolii au fost dificil de stabilit. Folatul, o vitamină B, este un factor important pentru o serie de căi metabolice, inclusiv metilarea ADN-ului și biosinteza nucleotidelor.1 În timp ce deficitul alimentar de folat este o problemă în mare parte din lumea în curs de dezvoltare, suplimentarea obligatorie cu folat a produselor din cereale din SUA și Canada, de la sfârșitul anilor 1990, a eliminat aproape deficitul de folat din aceste țări și a redus rata defectelor tubului neural.41

insuficiența

Folatul este important pentru sinteza purinelor și timidilatului, care sunt necesare pentru trifosfatul de adenozină mitocondrială și citosolică (ATP), trifosfatul de nucleotide totale (NTP) și deoxi-NTP (dNTP). cale donator de metil, fiind esențială pentru producerea de S-adenosilmetionină (SAM), care este esențială pentru metilarea ADN-ului, glutationului și a altor macromolecule. Important, în timp ce folii naturali din alimente sunt în principal tetrahidrofolați (THF), acidul folic (forma sintetică oxidată a folatului) este forma utilizată în principal pentru suplimentare, datorită sintezei sale economice și a bunei biodisponibilități.

Aportul ridicat de acid folic este obișnuit în societatea actuală, având în vedere atât suplimentarea de cereale, cât și consumul obișnuit de suplimente de vitamine suplimentare, băuturi energizante și cereale pentru micul dejun cu acid folic adăugat.32 Într-adevăr, multe cereale pentru micul dejun sunt fortificate la 160–175%. peste nivelurile raportate, 54 și adesea consumate cu mult peste dimensiunile de servire sugerate.6 În timp ce alocația dietetică recomandată (DZR) pentru folat este de 400 μg/zi, suplimentarea cu acid folic peste limita recomandată de 1000 μg/zi nu este neobișnuită pentru femei Doze zilnice chiar mai mari, de până la 5 mg, pot fi recomandate femeilor însărcinate cu anumite condiții prealabile, cum ar fi obezitatea, diabetul, starea MTHFR sau antecedente de sarcini asociate cu defecte ale tubului neural. 98 Având în vedere că folatul suplimentat este în principal sub formă de acid folic, care în mod normal nu este prezent in vivo și că acidul folic s-a dovedit că inhibă cel puțin o enzimă metabolică cheie, 10 este imperativ să obținem o u completă Înțelegerea modului în care această suplimentare afectează metabolismul celular.

Având în vedere că atât folatul dietetic scăzut cât și cel bogat au fost asociate cu diferite boli, în studiul de față am încercat să determinăm modul în care modulul nivelurilor de folat dietetic are impact asupra proceselor metabolice, de dezvoltare și fiziologice în celulele progenitoare hematopoietice. În mod surprinzător, am constatat că atât nivelurile insuficiente, cât și excesive de folat alimentar au compromis în mod similar metabolismul nucleotidic, ducând la defecte funcționale ale celulelor hematopoietice.

Methdos

Supliment de șoareci și folat

Șoarecii au fost hrăniți cu deficiențe (FD; 0,1 mg/kg acid folic), martor (CD; 2 mg/kg acid folic) sau diete supra-folate (SD; 10 mg/kg acid folic). 2 mg/kg acid folic respectă recomandările Institutului American de Nutriție pentru Rozătoare.21 Chow a fost achiziționat de la Research Diets (AIN-76A, cu excepția faptului că nivelurile de acid folic au fost variate) și a fost sterilizat prin iradiere. Toți chow-urile au fost suplimentate cu antibiotic succinilsulfathiazol pentru a preveni producția de folat din bacteriile intestinale.

Analiza spectrometriei de masă pentru metabolomica organelor

Progenitorii celulelor B ale măduvei osoase (BM) au fost izolați prin sortare celulară activată magnetică anti-B220 (Miltenyi Biotec) și prelucrați pentru analiza cromatografiei lichide ultra-performante - spectrometrie de masă (UHPLC-MS), așa cum este descris în Metodele suplimentare online.

Analiză metabolomică de rezonanță magnetică nucleară 1H-cantitativă nețeleasă

S-au extras progenitori izolați ai celulelor B de la animale în grup și s-au efectuat analize de rezonanță magnetică nucleară (RMN) pe un spectrometru Bruker de 500 MHz, așa cum este descris în Metode suplimentare online.

Transplanturi de măduvă osoasă

Pentru testele de transplant BM concurențiale prezentate în Figura 6, BM donator întreg de la șoareci pe diferite niveluri de folat dietetic (proteină fluorescentă verde (GFP) -) a fost amestecat la un raport de 3: 1 cu concurent BM (GFP +) de la șoareci care exprimă GFP alimentat cu diete normale de folat. Pentru testele de transplant BM concurențiale prezentate în Figura 6, BM donator întreg de la șoareci pe diferite niveluri de folat din dietă a fost amestecat la un raport de 3: 1 cu proteina fluorescentă verde (GFP) care exprimă concurentul BM de la șoareci alimentați cu diete normale de folat.

Analiza citometrică de flux și hemoleucograma completă

Suspensiile monocelulare au fost placate în plăci cu fund rotund cu 96 de godeuri și spălate în tampon de sortare a celulelor activate cu fluorescență (FACS) [3% ser fetal bovin (FBS) + soluție salină 1X fosfat tamponat (PBS) + acid etilendiamină tetraacetic 2mM (EDTA) ); v/v)]. După spălare, celulele au fost colorate la suprafață timp de 1 oră pe gheață în 50 μl de soluție de anticorp și analizate prin citometrie în flux pentru a identifica populațiile hematopoietice de interes. Anticorpii utilizați sunt enumerați în Metodele suplimentare online.

Numărul complet de sânge

Sângele periferic a fost colectat din vena laterală a cozii în tuburi de microfugă heparinizate la momentele indicate. Hemogramele complete au fost efectuate pe un Cell-Dyn 1700 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SUA).

Statistici

Au fost utilizate teste t nepereche, riscurile proporționale Cox și ANOVA unidirecțională pentru a analiza experimentele, cu semnificația indicată de * P

Figura 1. Șoarecii cu folat dietetic scăzut și bogat prezintă un număr redus de leucocite periferice. (A) Șoarecii BALB/c au fost hrăniți cu dietă martor (CD), cu deficit de folat (FD) și supra-folat (SD) timp de 4 luni, iar serul a fost colectat și analizat pentru prezența acidului folic utilizând un kit de testare microbiologică a acidului folic . Valorile reprezintă media ± SEM a (6 eșantioane totale). (B) Sunt prezentate greutățile șoarecilor BALB/c menținuți pe CD, FD și SD timp de șase luni. Greutățile reprezintă media ± SEM a 2 seturi independente de șoareci (6 eșantioane totale). (C și D) S-au efectuat hemoleucogramele complete pe sângele periferic colectat de la șoareci BALB/c păstrați pe diete CD, FD și SD folat timp de 2, 4 și 6 luni. Valorile reprezintă media ± SEM de la 5-10 șoareci/dietă la diferitele momente de timp. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind testul t Student în raport cu CD pentru fiecare experiment. Testul t al studentului a fost utilizat în (A) și (B) comparând atât dietele FD, cât și dietele SD cu CD. În (C) și (D), analizele statistice au fost efectuate folosind un test ANOVA unidirecțional, urmat de post-testul lui Tukey. * P

Având în vedere importanța folatului în producția de nucleotide și ATP, s-au efectuat numărări complete de celule sanguine pentru a determina dacă modificarea nivelurilor de folat din dietă a afectat populațiile circulante de celule sanguine. Numărul de leucocite a fost în mod constant redus la șoareci, atât pe dietele FD, cât și pe cele SD, ceea ce a fost evident cu 4-6 luni pe dietele modificate (Figura 1C). Până la 6 luni pentru aceste diete, reducerea numărului de limfocite periferice a fost, de asemenea, evidentă (Figura 1D). Reprezentarea neutrofilelor și a trombocitelor circulante nu a fost modificată semnificativ prin modularea nivelurilor de folat din dietă timp de până la 6 luni (Figura suplimentară online S1A-S1C); cu toate acestea, hemoglobina și celulele roșii din sânge au fost reduse semnificativ cu dietele FD în unele experimente, dar nu și în altele (Figura suplimentară online S1D). Important, șoarecii menținuți pe dietele FD, SD și CD timp de până la un an nu s-au putut distinge prin caracteristici observabile, inclusiv diferențe în greutate (Figura 1B și Figura suplimentară online S1E), activitate sau supraviețuire (datele nu sunt prezentate). Luate împreună, aceste observații arată că șoarecii din dietele FD și SD au menținut fenotipuri fizice normale, dar au prezentat niveluri circulante reduse de leucocite și limfocite.