Inhibarea HSP70 limitează invazia dependentă de FAK și îmbunătățește răspunsul la tratamentul cu melanom cu

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

Melanomul metastatic este o malignitate agresivă și de obicei fatală. Melanoamele avansate au mai mulți factori oncogeni și, în ciuda progreselor cu BRAF și inhibitori ai punctului de control imun, rezistența la terapie este o problemă semnificativă (1). Având în vedere eficacitatea incompletă și durabilitatea opțiunilor actuale de tratament și înclinația enormă a melanoamelor pentru rezistență, există o nevoie urgentă de a identifica noi ținte moleculare pentru melanom. În această lucrare, testăm ipoteza că proteina majoră de șoc termic inductibilă la stres 70 (numită și HSP72 sau HSPA1A, dar denumită în continuare HSP70) ar putea oferi o cale terapeutică nouă, atât singură, cât și în combinație cu terapiile actuale.

inhibarea

În această lucrare, am efectuat primul microarray tumoral de melanom pentru HSP70, folosind un anticorp specific pentru forma majoră indusă de stres care nu reacționează încrucișat cu alte izoforme (11). Arătăm că HSP70 este extrem de exprimat într-un procent mare de melanoame și că expresia acestei proteine ​​crește odată cu stadiul avansat. Folosim tehnica matricei de proteine ​​în fază inversă (RPPA) în melanoame pentru a identifica proteinele client HSP70 și a identifica pFAK și BRAF ca două proteine ​​client relevante și specifice melanomului HSP70. Arătăm că inhibarea pFAK utilizând inhibitorul HSP70 PET-16 duce la scăderea capacității melanoamelor de a migra, invada și metastaza in vivo. În plus, arătăm că forma mutantă V600E a BRAF, prezentă în până la 50% din tumorile melanomului, este un client al HSP70. În această direcție, arătăm că PET-16 se sinergizează cu inhibitori BRAF, păstrează citotoxicitatea în melanoamele rezistente la inhibitorii BRAF și extinde durabilitatea tratamentului cu inhibitori BRAF. Aceste date combinate augur pentru utilizarea eventuală a inhibitorilor HSP70 pentru terapia cu melanom.

Materiale și metode

Linii celulare, tratamente și reactivi

Toate liniile celulare de melanom uman au fost obținute din colecția Wistar Institute și au fost confirmate prin genotipare. Aceste celule au fost menținute în mediu L-15 (Cellgro) MCDB153 (Sigma)/Leibovitz (raport 4: 1) suplimentat cu 2% FCS și 2 mmol/L CaCl2. Celulele H1299, B16-F10 și fibroblastele au fost obținute de la ATCC în decurs de 6 luni de la utilizarea lor și au fost menținute în DMEM (Invitrogen). Linia celulară FS5, oferită cu amabilitate de Ashani Weeraratna (Institutul Wistar, Philadelphia, PA), a fost menținută în RPMI 1640, iar linia celulară Yumm1.7 (oferită cu amabilitate de Marcus Bosenburg, Universitatea Yale, New Haven, CT) a fost menținută în DMEM/F12 (Invitrogen). Toate mediile de mai sus au fost suplimentate cu 10% FBS (Invitrogen) și 100 U/ml penicilină și streptomicină. Stocurile de celule au fost amprentate folosind AmpFLSTR Identifier PCR Amplification Kit de la Life Technologies la Wistar Institute Genomics Facility. PET-16 (bromură de trifenil (feniletinil) fosfoniu; Sigma; catalog # S16773) și vemurafenib/PLX4032 (S1267; Selleckchem) au fost preparate sub formă de soluții stoc de 50 mmol/L în DMSO și depozitate la -80 ° C.

Western blot, imunoprecipitare și shRNA

Western blot a fost efectuat așa cum este descris (7). Anticorpii primari utilizați în acest studiu includ HSP70 (4873S; Cell Signaling Technology), anti-HA (3724; Cell Signaling Technology), FAK total (EMD Millipore; 05-537), FAK Tyr-397-P (44-625G; Invitrogen ), BRAF (sc-5284; Santa Cruz Biotechnology) și GAPDH (14C10; Cell Signaling Technology; 2118). Anticorpii secundari conjugați cu peroxidaza de hrean au fost folosiți la o diluție de 1: 10.000 (imunochimice Jackson). ECL (Amersham; RPN2232) a fost aplicat pe pete, iar nivelurile de proteine ​​au fost detectate folosind autoradiografia. Cuantificarea densitometriei semnalelor proteice a fost efectuată utilizând software-ul ImageJ (NIH). Pentru westernurile IP, 1.000 μg de lizat au fost imunoprecipitate așa cum este descris (12) cu 0,5 μg de antiseruri la HSP70, urmate de SDS-PAGE, transfer și analiză occidentală folosind antiseruri la FAK total, FAK Tyr-397-P și BRAF Linia celulară 1205Lu cu eliminarea shRNA a PTK2/FAK a fost generată de infecția cu vectorul lentiviral pLKO.1-puro purtând oricare dintre cele două secvențe shRNA împotriva PTK2 uman: shRNA (CCGGTCGAATGATAAGGTGTA; TRCN0000001620 și CAACAGGTGAAGAGCGATTAT; TR). Celulele stabile au fost selectate folosind puromicină (1 μg/ml), iar eliminarea PTK2/FAK a fost confirmată prin Western blot.