Influențele grase dietetice asupra fenotipului polipului la șoarecii cu neoplazie intestinală multiplă PNAS
Prezentăm aici efectele creșterii grăsimilor dietetice asupra formării și supraviețuirii polipului intestinal în acest model de șoarece de tumoare intestinală spontană.
MATERIALE ȘI METODE
Înființarea Fondului Imperial de Cercetare a Cancerului (ICRF) MIN C57/BL 6J Colonie.
Șoarecii heterozigoti MIN (C57BL/6JApc Min/+ Apc) au fost inițial obținuți în 1992 (cadou de la A. Moser, McArdle Labs, Universitatea din Wisconsin, Madison). Șoarecii masculi au fost inițial încrucișați înapoi la C57BL/6J de sex feminin (ICRF Biological Resources, Clare Hall, South Mimms, Hertfordshire, Marea Britanie), iar embrionii rezultanți au fost transferați prin histerectomie aseptică pentru mamele asistente în izolatori specifici fără patogeni. Toată reproducerea a fost efectuată ulterior în unități specificate fără patogeni de către împerechere fratele (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) -soră (C57BL/6J).
Genotiparea a fost efectuată printr-o reacție bazată pe PCR utilizând trei primeri incluzând un control intern pentru ADN-ul normal de șoarece, așa cum este descris (15). ADN-ul a fost extras din tăieturile urechii sau cozii la vârsta de 21 de zile. Pe scurt, tăieturile de urechi au fost puse în 20 ml de tampon de liză proaspăt preparat [12,5 μl 1 M Tris (pH 8)/1 μl 5 M NaCI/2,5 μl 10% SDS/25 μl 10 mg/ml proteinază K/250 μl dublu autoclavat -H2O distilat] și amestecat și încălzit într-o baie de 55 ° C timp de 1 oră, amestecat din nou și încălzit timp de încă 2 ore și transferat pe gheață. S-au adăugat optzeci de microlitri de ddH2O și digestul a fiert timp de 15 minute pentru a dezactiva proteinaza K. Apoi, s-au folosit 2,5 pl din acest amestec pentru o PCR de 25 pl. Alternativ, 1 cm de coadă de șoarece fragmentată (obținută sub anestezie) a fost plasată în tampon de liză a cozii (700 μl TENs/35 μl 20% SDS/35 μl de 10 mg/ml proteinază K) și incubată peste noapte la 56 ° C. ADN-ul a fost obținut prin extracția standard de fenol/cloroform cu precipitații de izopropanol și stocat în 250 μl TE. O jumătate de microlitru din acest amestec a fost utilizată pentru un PCR de 25 pl.
Două sute douăzeci și nouă (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) (MIN) și 23 (C57BL/6J- + Apc/+ Apc) (de tip sălbatic) șoareci au fost stratificați aleatoriu prospectiv (de la peste 50 de împerechere) în 3 grupe dietetice după cum urmează:
(i) O dietă „standard” cu un conținut total de grăsimi de aproximativ 3% (Dieta ICRF pentru rozătoare GR3EK.R20, Servicii dietetice speciale, Witham, Essex, Regatul Unit). Conținutul de fibre brute al acestei diete (evaluat prin tehnica de extracție acidă/alcalină) este de 4,1%, iar conținutul de carbohidrați și proteine brute de 58% și respectiv 19,8%.
(ii) O dietă „Grasă” cu un conținut total de grăsimi de minimum 10% [Teklad dieta crescătorului de șoareci (W) 8626; Madison, WI] a obținut din aceeași sursă ca cea utilizată în primele date publicate despre MIN (11). Alți constituenți decât conținutul de grăsimi din această dietă au variat, de asemenea, de la dietele (i) și (iii) prin aceea că conținutul de fibre brute este înjumătățit la 2%, deși proteina brută este similară cu 20%.
(iii) O dietă „bogată în grăsimi” cu un conținut total de grăsimi de aproximativ 15%. Aceasta a fost reconstituită în mod specific prin SDS de la 85% din greutatea dietei standard ICRF pentru rozătoare GR3EK.R20 (adică, ca dietă și mai mult), cu un ulei de porumb suplimentar de 15% din greutate. Cei patru constituenți principali ai acizilor grași ai uleiului de porumb folosit sunt: 42,9% linoleic, 23,4% oleic, 9,8% palmitic și 2% steric.
Dietele standard (i) și bogate în grăsimi (iii) sunt, prin urmare, similare, în afară de conținutul total de grăsimi, în timp ce dieta (ii) Grăsimea diferă în grăsimi și are o compoziție mai mică de fibre. Gama de diete a fost selectată parțial pentru a contribui la numărul de polipi substanțial mai scăzut și la creșterea supraviețuirii pe care am observat-o inițial la șoarecii ICRF MIN, comparativ cu datele publicate inițial din care proveneau șoarecii noștri MIN (11).
Dietele au fost alocate aleatoriu și au fost inițiate ad libitum de la înțărcare la vârsta de aproximativ 21 de zile, după transferul lor către izolatoare dedicate găzduite într-o unitate separată „deschisă” (adică, în condiții normale de laborator pentru animale fără patogeni nespecificați). Nu s-a făcut nicio încercare de ajustare pentru valorile dietetice calorice, deoarece aportul și utilizarea calorifică la șoareci nu sunt ușor de controlat sau de evaluat și se agravează în continuare de diferențele potențiale în gustul dintre cele trei diete. Au fost raportate, de asemenea, manipularea alimentară anormală, inclusiv rezistența la obezitate la șoarecii de laborator C57BL pentru care baza nu este clară (16). Șoarecii au fost totuși cântăriți în grupurile lor stratificate săptămânal, de la înțărcare până la sacrificiu. Șoarecii C57BL/6J- + Apc/+ Apc din fiecare sex au fost, de asemenea, alocați aleatoriu ca martori negativi în cadrul fiecărui grup dietetic pentru a exclude posibilele efecte adverse neașteptate și, de asemenea, ca martori pozitivi pentru comparațiile de greutate. Acest lucru a fost pentru a ne asigura că observațiile noastre nu au fost confundate cu efecte dăunătoare independente de fenotipul MIN sau, invers, de manipulare dietetică anormală care ar putea fi dependentă de MIN.
Nevoia de sacrificiu a fost determinată de tehnicieni independenți care au evaluat șoarecii zilnic. Mortalitatea MIN se datorează de obicei anemiei progresive severe, prolapsului rectal sau obstrucției intestinale. Progresia unei tumori mamare la peste 1 cm în diametru necesită, de asemenea, sacrificiu. Când a fost posibil, post-mortemurile, numărarea și măsurătorile au fost efectuate cu o singură orb de către o singură persoană (H.S.W.), în caz contrar măsurătorile tumorale au fost ignorate. La post mortems intestinul a fost izolat, disecat longitudinal, spălat de trei ori în PBS și răspândit pe hârtie 3MM. Intestinul subțire a fost împărțit în trei secțiuni aproximativ egale [proximal (SB1), mijlociu (SB2) și distal (SB3)]. O evaluare a numărului vizibil, a mărimii [media celor două diametre cele mai mari cu etriere digitale (Micron Sales, Londra)] și a distribuției tumorilor intestinale a fost făcută apoi la un microscop de disecție × 10. Acuratețea rezoluției dimensiunii tumorii prin această abordare a necesitat numărarea pe interval de 1 mm. Secțiunile au fost apoi fixate în soluție salină formală de 9% și încorporate în parafină pentru evaluare histologică. Toate procedurile sunt aprobate de comitetul de etică a animalelor ICRF.