Inflamația sistemică și vasculară într-un model in-vitro al obezității centrale
Arti Ahluwalia
1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia
Alessandra Misto
2 Consiliul Național Italian de Cercetare, Institutul de Fiziologie Clinică, Pisa, Italia
Federico Vozzi
2 Consiliul Național Italian de Cercetare, Institutul de Fiziologie Clinică, Pisa, Italia
Chiara Magliaro
1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia
Giorgio Mattei
1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia
Maria Cristina Marescotti
3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia
Angelo Avogaro
3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia
Elisabetta Iori
3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia
Date asociate
Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.
Abstract
Tulburările metabolice datorate supra-nutriției sunt o problemă majoră de sănătate la nivel mondial, adesea asociată cu obezitatea și morbiditățile asociate. Obezitatea este specifică oamenilor, deoarece este asociată cu stilul de viață și dieta și este atât de dificil de reprodus în modelele animale. Aici descriem un model de adipozitate centrală umană bazat pe un sistem cu 3 țesuturi constând dintr-o serie de module fluidice interconectate. Având în vedere legătura cauzală dintre obezitate și inflamația sistemică, ne-am concentrat în primul rând pe markerii proinflamatori, examinând asemănările și diferențele dintre modelul cu 3 țesuturi și dovezile din studiile la om în literatura de specialitate. Atunci când este provocat cu niveluri ridicate de adipozitate, sistemul in-vitro manifestă stres cardiovascular prin expresia E-selectinei și a factorului von Willebrand, precum și a inflamației sistemice (exprimând IL-6 și MCP-1), așa cum se observă la om. Interesant este că majoritatea răspunsurilor sunt dependente de interacțiunea sinergică dintre adipozitate și prezența mai multor tipuri de țesuturi. Amenajarea are potențialul de a reduce experimentele pe animale în cercetarea obezității și poate ajuta la dezlegarea mecanismelor celulare specifice care stau la baza răspunsului țesutului la supraîncărcarea nutrițională.
Introducere
Supraponderabilitatea și obezitatea sunt factori de risc majori pentru o serie de boli cronice, inclusiv diabetul [1], bolile cardiovasculare și cancerul [2]. De la începutul secolului, numărul adulților obezi a crescut la peste 300 de milioane. Persoanele obeze au adesea exces de adipozitate viscerală centrală, o afecțiune care contribuie la o creștere cronică a acizilor grași liberi circulanți și a metaboliților, cum ar fi glicerina și trigliceridele. La rândul lor, acești metaboliți activează diverse cascade de semnalizare care interferează cu semnalizarea insulinei și funcția celulelor β, contribuind în continuare la gluco/lipotoxicitate [3].
O mulțime de cercetări au fost dedicate pentru a delimita mecanismele etiopatogene ale obezității și diabetului utilizând modele animale. Cele mai utilizate modele de obezitate sunt rozătoarele, șoareci sau șobolani mutanți sau modificați genetic, în care adipozitatea este indusă de hrănirea prelungită cu diete bogate în grăsimi [4,5]. După cum a spus succint Wang și colab., „În ciuda utilizării extinse a acestor modele de rozătoare, multe detalii mecaniciste ale metabolismului uman rămân slab înțelese, iar opțiunile de tratament pentru oameni sunt limitate și în mare parte nesatisfăcătoare” [6]. Într-adevăr, acum știm multe despre detaliile metabolismului rozătoarelor, dar încă nu avem o înțelegere detaliată a mecanismelor care stau la baza homeostaziei glucozei umane și a răspunsului la supra-nutriția cronică, precum și a comorbidităților legate de obezitatea umană și a răspunsurilor la intervenții [7].
Pe lângă diferențele evidente între durata de viață a omului și rozătoarele, dieta și biologia de bază, modelele animale nu sunt susceptibile disocierii dinamicii metaboliților în diferite țesuturi și organe. În consecință, identificarea contribuției țesuturilor sau organelor individuale la echilibrul sau destabilizarea nutrienților este o sarcină formidabilă. S-au făcut câteva încercări de modelare a obezității umane utilizând tehnici in vitro, cele mai multe dintre acestea se referă la culturi de celule adipoase sau țesuturi derivate din linii celulare sau izolate de la donatori [8,9]. Cercetarea in vitro a contribuit în mod semnificativ la înțelegerea modificărilor semnalizării la nivelul membranei sau citoplasmatic la celule individuale [10,11]. Astfel, deși există în mod clar o rețea de semnalizare între diferite țesuturi care contribuie la menținerea homeostaziei energetice în corpul uman, o mare parte din înțelegerea noastră despre transducția semnalului este limitată la un spațiu și o fereastră de timp foarte mici. Întrebarea privind modul în care semnalele metabolice sunt propagate și traduse de către țesuturile și organele îndepărtate și modul în care mediul intern este modulat de acestea nu a fost încă abordată, cu foarte puține cercetări efectuate cu privire la modele la nivel superior de metabolism endogen care conțin celule sau țesuturi diferite tipuri.
Material si metode
Celulele
La fel ca în studiile noastre anterioare, proporțiile celulare în structura cu 3 căi au reprezentat raportul hepatocit: adipocit: endotelial în regiunea viscerală, adică 12% AT 10: 2: 1 pentru greutatea normala; 25% AT 10: 4: 1 pentru supraponderalitate; 35% AT 10: 6: 1 pentru obezi [18].
Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC, pasajele 4-6) provin de la Promocell. Au fost cultivați în ECGM (mediu de creștere a celulelor endoteliale, Promocell) cu 10% di FBS (ser bovin fetal), 0,1 ng/ml EGF (factor de creștere epidermică), 1,0 ng/ml BFGF (factor de creștere a fibroblastului de bază), 90 μg/ml heparină, 1,0 μg/ml hidrocortizon și pen-strep. Acest cocktail este denumit în continuare media obișnuită. Celulele (38.000) au fost pipetate în μ-Slides care au fost preparate prin acoperire cu 200 μL de gelatină 1% urmată de pre-incubare de 24 de ore într-un cuptor la 37 ° C.
Linia celulară de hepatocite HepG2 provenea din ATCC (American Type Culture Collection). Aceste celule mențin principalele funcții endogene ale hepatocitelor umane și răspund la glucoză-6-fosfat, păstrându-și capacitatea de a sintetiza glicogenul [23]. Hepatocitele au fost trecute în EMEM cu 1g/L glucoză, 5% FBS și pen-strep. 150.000 de celule au fost pipetate cu atenție în centrul schelelor poroase de colagen (porozitate 98%, dimensiunea porilor 200 μm, modul elastic 1,2 kPa) plasate în plăci cu 48 de godeuri. Celulele au fost incubate în mediul comun cu 48 de ore înainte de începerea experimentelor de cultură conectate. După acest timp, celulele proliferează la aproximativ 400.000-450.000, după cum se constată prin citometrie, și sunt pregătite pentru experimentele cu 3 căi.
Țesutul adipos visceral a fost obținut de la n = 9 donatori supuși rezecției hepatice pentru leziuni hepatice metastatice/benigne, fără boli hepatice cronice subiacente sau complicații diabetice și IMC (indicele de masă corporală) cuprins între 20 și 25. Toți pacienții și-au dat consimțământul scris în scris pentru a participa în studiu, care a fost aprobat de Comitetul Etic Local (Studiul nr. 3059 aprobat la 21/07/2011 de către Azienda Ospedaliera Università Pisana). Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare stabilite de Comitetul Etic Local. Țesutul a fost curățat de vase de sânge vizibile și împărțit în porțiuni cântărite reprezentând i) normo-greutate, 56 mg, ii) supraponderal, 112 mg și iii) obez, 168 mg. Probele cântărite au fost plasate în godeuri și parțial digerate în colagenază (Sigma) timp de 10 minute. Au fost apoi clătite în EMEM cu 20% FBS și pen-strep înainte de a fi introduse în bioreactoare. Folosind această procedură, obținem un randament de aproximativ 1500 adipocite/mg [22].