Indol-3-carbinolul fitochimic dietetic este un inhibitor enzimatic al elastazei naturale care perturbă

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de John E. Halver, Universitatea din Washington, Seattle, WA și aprobat la 20 octombrie 2008 (primit pentru examinare la 18 iulie 2008)

este

Abstract

Creșterea celulară eucariotă se bazează pe activarea complexelor de proteine ​​ciclină/kinază dependentă de ciclină (CDK) care funcționează în etape specifice ale ciclului celular (23). Multe tumori mamare prezintă niveluri ridicate de ciclină E și ciclină D, care implică pierderea controlului ciclului celular prin dereglarea fazei G1 a ciclului celular (24, 25). Ambele forme de ciclină cu greutate moleculară mare și cu greutate moleculară mai mică au fost detectate în celulele de mamifere. Interesant este faptul că multe țesuturi extrem de proliferative, cum ar fi cel al cancerului de sân metastatic, exprimă predominant formele de ciclină cu greutate moleculară mai mică (26-28), în timp ce țesutul normal corespunzător prezintă, în general, o formă de ciclină cu greutate moleculară mai mare ( 26).

Am raportat anterior că tratamentul I3C al celulelor cancerului mamar uman MCF-7 a cauzat formarea unui complex proteic inactiv, 200-kDa CDK2 în comparație cu un complex proteic activ, 90-kDa CDK2 observat în celulele în creștere netratate (29). În absența I3C, formele de ciclină E cu masă moleculară mai mică de 35-/33-kDa sunt asociate cu CDK2, care s-a dovedit că conferă hiperactivitate complexului proteic CDK2 și crește proliferarea celulară (27). În schimb, după tratamentul cu I3C, forma predominantă a ciclinei E este o specie de masă moleculară mai mare de 50 kDa care produce un complex proteic CDK2 inactiv (29). Astfel, tratamentul I3C restabilește controlul fazei G1 a ciclului celular în celulele cancerului de sân uman prin promovarea acumulării ciclinei E de 50 kDa în locul formelor de masă moleculară inferioară a ciclinei E.

Rezultate

I3C inhibă direct activitatea elastazei umane și prelucrarea proteinei ciclinei E.

Folosind testul de procesare in vitro a ciclinei E, efectele inhibitoare ale I3C asupra activității elastazei neutrofile umane au fost comparate cu inhibitori de elastază bine caracterizați, elastatinal (Elast) și metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetonă (CMK) (37, 38 ). Așa cum se arată în FIG. 1C, I3C a fost la fel de eficient ca elastatinal sau CMK în prevenirea procesării dependente de elastază a ciclinei 50-kDa E. În absența oricăror inhibitori ai elastazei, forme de ciclină E cu greutate moleculară mai mică pot fi detectate într-o elastază. mod dependent (ADN Cyc E vs. benzi elastază DMSO).

Specificitatea indolului inhibării elastazei.

Specificitatea indolului inhibiției I3C a activității enzimatice a elastazei. (A) Analiza de citometrie în flux a celulelor MDA-MB-231 tratate 72 de ore cu controlul vehiculului DMSO, 100 μM I3C, 30 μM DIM sau 100 μM triptofol. (B) Celulele MDA-MB-231 au fost tratate cu 100 μM I3C, 30 μM DIM, 100 μM triptofol sau controlul vehiculului DMSO timp de 72 de ore. Jumătate din ciclina E imunoprecipitată a fost evaluată pentru activitatea kinazei CDK2 asociate utilizând Histona H1 ca substrat in vitro, iar cealaltă jumătate a fost analizată pentru formularea ciclinei E prin Western blots. (C) Efectele indolilor asupra procesării elastazei neutrofile umane a ciclinei E au fost analizate utilizând un sistem de transcriere-traducere in vitro, așa cum este descris. Amestecurile de reacție indicate conțineau controlul vehiculului DMSO, 50 μM I3C, 30 μM DIM sau 50 μM triptofol.

Testul de procesare a proteinei ciclinei E in vitro folosind elastază purificată a fost utilizat pentru a evalua indolul selectiv de inhibare a elastazei. Așa cum se arată în FIG. 2C, I3C a inhibat procesarea in vitro a ciclinei E mediată de elastază prin aceea că nivelul ciclinei E de 50 kDa rămas a fost similar cu cel detectat în absența oricărei elastaze adăugate (banda ADN Cyc E). În contrast, în prezența DIM sau a triptofolului, procesarea mediată de elastază a ciclinei E de 50 kDa a fost similară cu reacțiile de procesare in vitro de control ale vehiculului, ceea ce demonstrează că activitatea elastazei nu a fost inhibată de nici o moleculă. Zimografia elastazei purificate a confirmat aceste rezultate, prin faptul că I3C, dar nu DIM sau triptofolul, a inhibat direct activitatea elastazei (datele nu sunt prezentate).

I3C acționează ca un inhibitor necompetitiv al activității enzimatice a elastazei umane.

Analiza cinetică a inhibării indolului activității elastazei. (A) Testul de procesare in vitro a elastinei ciclinei E a fost utilizat pentru a determina efectele I3C asupra Km și Vmax pentru activitatea enzimatică a elastazei neutrofile umane. Elastaza umană, concentrațiile de substrat ale ciclinei E indicate și concentrația indicată de I3C au fost toate amestecate la un volum total de 20 μL și incubate timp de 5 minute la 37 ° C urmate de analiza Western blot a ciclinei E. Viteza de reacție a fost determinată ca funcția pierderii proteinei ciclinei E de 50 kDa și au fost reprezentate grafic față de concentrația ciclinei E. (B) Lineweaver - Analiza grafică Burk și Dixon a inhibiției I3C a procesării elastazei ciclinei E utilizând reacțiile de transcriere - traducere in vitro. Graficarea dublă reciprocă de 1/viteză față de 1/substrat dă graficul Lineweaver - Burk. Pentru graficele Dixon, raportul 1/V a fost reprezentat în funcție de diferitele concentrații de I3C la 2 concentrații diferite de substrat (0,6 și 1,2 ng), iar valorile Ki au fost determinate grafic ca interceptare cu abscisa. (C) Lineweaver - Analiza grafică Burk și Dixon a inhibării I3C a hidrolizei elastazei umane a substratului cromogen metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilidă (MetS).