Inactivarea luminii albastre antimicrobiene a agenților patogeni gram-negativi din biofilme in vitro și in vivo
Yucheng Wang
1 Departamentul de Medicină Laser, Spitalul General PLA din China, Beijing
2 Colegiul de Medicină, Universitatea Nankai, Tianjin
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Ximing Wu
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Jia Chen
3 Spitalul de Dermatologie din Shanghai, China
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Reabilitare Amin
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Min Lu
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Brijesh Bhayana
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Jie Zhao
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Clinton K. Murray
7 Serviciul de boli infecțioase, Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, Texas
Michael R. Hamblin
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
6 Harvard-MIT Divizia de Științe și Tehnologie a Sănătății, Cambridge, Massachusetts
David C. Hooper
Divizia a 5-a de Boli Infecțioase, Spitalul General din Massachusetts, Harvard Medical School, Boston
Tianhong Dai
4 Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston
Abstract
fundal. Biofilmele afectează> 80% din infecțiile bacteriene la om și sunt de obicei dificil de eradicat datorită rezistenței lor inerente la medicamente.
Metode. Am investigat eficacitatea luminii albastre antimicrobiene (aBL) (lungime de undă, 415 nm) pentru inactivarea biofilmelor Acinetobacter baumannii sau Pseudomonas aeruginosa în microplăci cu 96 de godeuri sau răni infectate cu arsuri de șoarece.
Rezultate. In vitro, în microplăci cu 96 de godeuri, expunerea biofilmelor A. baumannii de 24 de ore și 72 de ore la 432 J/cm2 aBL a dus la inactivarea a 3,59 log10 și 3,18 log10 unități care formează colonii (CFU), respectiv. Pentru biofilmele P. aeruginosa s-au atins niveluri similare de inactivare - 3,02 log10 și respectiv 3,12 log10 CFU. În rănile arse la șoarece infectate cu 5 × 106 CFU de A. baumannii, aproximativ 360 J/cm 2 și 540 J/cm 2 aBL a fost necesară pentru a inactiva 3 log10 CFU în biofilme atunci când au fost livrate 24 și respectiv 48 de ore, după inocularea bacteriană . Analiza cromatografiei lichide de înaltă performanță a relevat prezența porfirinelor endogene atât în A. baumannii, cât și în P. aeruginosa. Testul TUNEL nu a detectat celule apoptotice în pielea de șoarece iradiată de aBL până la 24 de ore după expunerea la aBL (540 J/cm2).
Concluzii. aBL are activitate antimicrobiană în biofilmele de A. baumannii și P. aeruginosa și este o abordare terapeutică potențială pentru infecțiile legate de biofilm.
Biofilmele afectează> 80% din infecțiile bacteriene la om [1]. În biofilme, bacteriile vii sunt grupate împreună într-o matrice extracelulară foarte hidratată [2, 3]. Epuizarea substanțelor metabolice sau acumularea de deșeuri în biofilme determină intrarea bacteriilor într-o stare lentă sau necrescentă (staționară) [3]. În consecință, biofilmele sunt mai tolerante la medicamentele antimicrobiene convenționale și la apărarea gazdei, în comparație cu omologul lor planctonic [4, 5] și sunt asociate cu infecții persistente [6, 7]. Situația este agravată de apariția tot mai mare a tulpinilor bacteriene rezistente la medicamente, în special bacterii gram-negative rezistente la medicamente [8]. Sunt necesare noi abordări terapeutice pentru a combate rezistența la medicamente în infecțiile legate de biofilm [9].
O nouă abordare antimicrobiană bazată pe lumină, lumina albastră antimicrobiană (aBL), a atras atenția din ce în ce mai mult datorită efectului său antimicrobian intrinsec fără implicarea fotosensibilizatorilor exogeni [10-14]. Mecanismul care stă la baza activității antimicrobiene a aBL nu este încă pe deplin înțeles. O ipoteză obișnuită este că aBL excită cromoforii fotosensibilizatori endogeni naturali (în principal porfirine fără fier) și conduce ulterior la producerea speciilor de oxigen reactiv citotoxic (ROS) [14]. În studiile noastre anterioare, am demonstrat că aBL celulele bacteriene planctonice inactivate selectiv (inclusiv tulpini multirezistente) păstrând în același timp celulele gazdă și că a eliminat cu succes infecțiile acute din rănile șoarecilor [15-17]. În prezentul studiu, am investigat în continuare eficacitatea inactivării aBL a biofilmelor Pseudomonas aeruginosa și Acinetobacter baumannii în microplăci cu 96 de godeuri sau plăgi cu arsuri de șoarece cu infecții stabilite.
MATERIALE ȘI METODE
Sursă de lumină albastră
Pentru iradierea aBL, am folosit un prototip de diodă emițătoare de lumină (LED; Vielight, Toronto, Canada) cu emisie maximă la 415 nm și lățime completă la jumătate de maxim 10 nm. LED-ul a fost montat pe un radiator pentru a preveni efectele termice asupra țintei iradiate. Iradianța de pe suprafața țintei a fost ajustată prin manipularea distanței dintre diafragma sursei de lumină și țintă și a fost măsurată folosind un contor de putere/energie PM100D (Thorlabs, Newton, New Jersey).
Tulpini bacteriene
Tulpinile bacteriene utilizate în acest studiu au fost P. aeruginosa ATCC 19660 (tulpina 180) și un izolat clinic rezistent la medicamente de A. baumannii. Ambele tulpini au fost făcute bioluminescente prin transfectarea operonului lux în tulpinile bacteriene așa cum s-a descris anterior [18, 19], permițând monitorizarea în timp real a bioluminiscenței de la bacterii utilizând imagistica cu bioluminescență. Bacteriile au fost cultivate în mod obișnuit în mediu de infuzie a inimii creierului (BHI) suplimentat cu 50 ug/ml kanamicină într-un incubator orbital (37 ° C; 1300g).
Corelația luminescenței bacteriene cu unitățile care formează colonii (CFU) în biofilme
Suspensiile bacteriene din BHI au fost incubate în microplăci cu 96 de godeuri (200 μL/godeu; aproximativ 106 CFU/mL) timp de 24 de ore pentru a permite creșterea biofilmului [20-22]. La sfârșitul perioadei de incubație, biofilmele au fost spălate cu atenție de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) pentru a îndepărta bacteriile neadezive și s-au adăugat 200 pl de PBS în fiecare godeu. Biofilmele din diferite godeuri au fost apoi expuse la aBL la o iradiere de 100 mW/cm2 pentru perioade diferite. După expunerea la aBL, biofilmele au fost supuse atât măsurării intensității luminiscenței (în unități de lumină relativă [RLU]), utilizând un cititor de plăci multi-etichetă Victor-2 1420 (EG&G Wallac, Gaithersburg, Maryland), cât și un test de formare a coloniilor. Pentru testul de formare a coloniilor, fiecare godeu a fost atent sfărâmat și apoi vibrat prin sonicare timp de 1 minut. Suspensiile au fost apoi colectate și placate pe agar BHI după diluții seriale utilizând metoda descrisă anterior [23]. Numărul total de CFU din biofilme a fost determinat și echipat liniar cu luminiscența bacteriană corespunzătoare.
aBL Inactivarea bacteriilor în biofilme in vitro
Suspensiile bacteriene din bulionul BHI au fost incubate în microplăci cu 96 de godeuri (200 μL/godeu; aproximativ 106 CFU/mL) timp de 24 sau 72 de ore pentru a permite creșterea biofilmului [20-22]. În timpul incubației, mediul de cultură a fost schimbat în fiecare zi. La sfârșitul incubației, biofilmele au fost spălate cu atenție de două ori folosind PBS și 200 μL de PBS proaspăt au fost adăugate în fiecare godeu. Biofilmele au fost apoi iradiate cu aBL la o iradiere de 100 mW/cm2. La diferite momente de timp după inițierea iradierii aBL, luminiscența bacteriană a biofilmelor a fost măsurată folosind cititorul de plăci multietichete, iar viabilitatea bacteriană în biofilme a fost estimată pe baza luminiscenței bacteriene. Experimentul a fost realizat în 4 replici pentru fiecare condiție.