Îmbunătățirea imunității celulelor T CD8 în plămâni de către oligodeoxinucleotide CpG Crește protecția

Abstract

Oligodeoxinucleotidele CpG imunostimulatoare (ODN) 2 sunt similare cu cele din ADN bacterian și stimulează răspunsul imun în favoarea producției de citokine de tip Th1 și proinflamatoare (1, 2, 3, 4). CpG ODN poate fi recunoscut de TLR9 al sistemului imunitar înnăscut, care declanșează o cascadă imunomodulatoare de imunitate adaptativă. S-a demonstrat că CpG ODN poate spori răspunsurile imune înnăscute (5) și rezistența împotriva bolilor infecțioase și poate servi drept adjuvant pentru îmbunătățirea răspunsurilor imune adaptive împotriva agenților patogeni (6).

Deși eficacitatea CpG ODN ca adjuvanți de vaccin pentru vaccinurile ADN, proteine și peptide este bine cunoscută (7, 8, 9, 10, 11), nu se știa dacă aceștia ar servi drept adjuvanți eficienți pentru vaccinurile cu vectori virali vii. Virușii poartă propriii lor liganzi TLR, cum ar fi ssRNA sau dsRNA, care se leagă de TLR7/8 sau respectiv TLR3. Astfel, nu se știe dacă CpG ODN, ca ligand TLR9, ar contribui în continuare la inducerea imunitară. În acest studiu, am abordat această întrebare în cazul vaccinului Ankara modificat (MVA) (12, 13, 14) ca vaccin împotriva provocării letale a vaccinului, un model pentru variolă. Cu toate acestea, rezultatele ar trebui să fie aplicabile altor vaccinuri vectoriale virale care exprimă vaccin recombinant Ags (15, 16, 17, 18).

Materiale și metode

Oligodeoxinucleotide

ODN au fost sintetizate la Centrul de Evaluare Biologică și Cercetare. Stimularea imunitară a fost obținută prin administrarea a două ODP CpG (GCTAGACGTTAGCGT și TCAACGTTGA). Motivele CpG au fost trecute la TpG sau GpC în control ODN (GCTAGATGTTAGGCT și TCAAGCTTGA). Nici endotoxina (măsurată prin analiza cromogenică a lizatului de amibocit Limulus) și nici proteina (măsurată prin trusa de testare a proteinelor acidului bicinchoninic; Pierce Chemicals) nu au fost detectabile în niciun preparat ODN. Am folosit 25-100 μg de ODP CpG sau ODN de control pe doză per animal.

Viruși

Tulpina WR a virusului Vaccinia a fost inițial obținută din colecția American Type Culture. Virusul Vaccinia Wyeth, tulpina New York City Board of Health, a fost obținută de la Wyeth Laboratories. Ambele au fost crescute în celule HeLa și titrate în celule BSC-1. Tulpina MVA a virusului Vaccinia, obținută de la A. Mayr (Universitatea din München, München, Germania) (12, 13), a fost propagată și titrată în celule de fibroblast de embrion de pui. Acest virus a fost un cadou de la Dr. B. Moss, P. Earl și L. Wyatt (Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase (NIAID), Bethesda, MD) (23).

Șoareci, imunizare și provocare

Șoarecii BALB/c de sex feminin au fost cumpărați de la Centrul de Cercetare a Cancerului Frederick. Șoarecele knockout Jh poartă o ștergere țintită a locusului JH, astfel încât șoarecii sunt homozigoti pentru absența tuturor celor patru segmente genetice JH, rezultând celule care nu pot produce o versiune completă, recombinată a regiunii variabile a lanțului H și sunt de aceea deficiente de celule B. Această tulpină a fost realizată pe fundalul BALB/c (Taconic Farms). Pentru studii de protecție, șoarecii BALB/c sau șoarecii cu deficit de celule B au fost imunizați cu diferite doze de MVA i.m. sau IN. La o lună după imunizare, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de WR, iar greutatea corporală individuală a fost măsurată zilnic. Șoarecii cu scădere în greutate> 25% au fost obligați să fie eutanasiați, necesitând în general încheierea experimentelor în jurul zilei a 8-a, când grupul de control a atins acest nivel. Experimente similare de protecție a duratei pentru vaccinia au fost utilizate anterior (20, 24). Epuizarea celulelor CD8 + sau CD4 + s-a făcut prin i.p. tratament cu mAb zilnic timp de 4 zile (clona 2,43, 0,5 mg/șoarece/zi pentru CD8 și GK 1,5, 1 mg/șoarece/zi pentru CD4) (40, 41). Epuizarea a fost verificată prin analiza FACScan a celulelor sanguine periferice pentru a fi> 98% epuizate.

Purificarea celulelor

Splinele au fost îndepărtate aseptic și suspensiile monocelulare au fost preparate prin trecerea ușoară a țesutului prin ecrane sterile. Eritrocitele au fost lizate cu clorură de amoniu tamponată cu Tris, iar celulele rămase au fost spălate extensiv în RPMI 1640 (BioWhittaker) conținând 2% FBS (Gemini Bio-Products) (42). Plămânii au fost excizați, evitând ganglionii limfatici paratraheali, și spălați de două ori în RPMI 1640. Suspensiile de celule mononucleare pulmonare intra-chimale au fost izolate prin digestie colagenază/DNază și centrifugare cu gradient Percoll așa cum s-a descris anterior (43).

IFN-γ ELISPOT

Plăcile ELISPOT (Millipore) au fost pre-acoperite peste noapte cu anti-IFN-y Ab (Mabtech). Celulele țintă (P815, un mastocitom DBA/2 care exprimă molecule de clasa I, dar nu de clasa II H-2 d) au fost infectate peste noapte cu virusul vaccin vSC8 (44), spălate de două ori și iradiate cu UV timp de 15 minute. Celulele efectoare splenice au fost amestecate cu celule țintă infectate și centrifugate împreună în tuburi conice timp de 3 minute la 200 × g. Celulele au fost cocultivate împreună timp de 1 oră la 37 ° C și apoi transferate pe placa ELISPOT într-un volum de 150 μl/godeu. După 24 de ore de cocultivare, celulele formatoare de pete IFN-γ au fost dezvoltate de anti-IFN-γ Ab secundar (Mabtech), un kit Vectasin ABC (Vector Laboratories) și un kit de substrat AEC (Vector Laboratories). Deoarece celulele noastre țintă (celule P815) exprimă doar molecule MHC clasa I, nu clasa II, (H-2K d, D d și L d), ne așteptăm ca majoritatea celulelor producătoare de IFN-γ să fie CD8 + clasa I Celule T cu restricție MHC.

Test de neutralizare a virusului Vaccinia pe baza FACS

Testul de neutralizare a virusului Vaccinia s-a făcut pe baza detecției citometrice în flux a GFP așa cum este descris de Earl și colab. (45).

metode statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind un test t asociat, comparând pierderea în greutate și supraviețuirea în grupuri de șoareci imunizați și neimunizați după provocarea virusului vaccinia (WR) (46).

Rezultate

Eficacitatea de protecție a imunizării cu MVA a fost îmbunătățită prin utilizarea CpG ODN ca adjuvant al mucoasei pentru imunizarea IN la șoarecii BALB/c. Grupuri de șoareci BALB/c (5/grup) au fost imunizați IN cu 0, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 și 10 7 PFU fără (A) sau cu (B) CpG ODN (25 μg/doză) . O lună mai târziu, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de vaccin WR. Pierderea individuală în greutate măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.

A, Eficacitatea de protecție a imunizării cu MVA nu poate fi îmbunătățită prin utilizarea controlului ODN ca adjuvant al mucoasei pentru imunizarea IN la șoarecii BALB/c. Grupuri de șoareci BALB/c (5/grup) au fost imunizate IN cu MVA 10 5 cu sau fără control ODN (25 μg/doză). Trei săptămâni mai târziu, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de vaccin WR. Pierderea individuală în greutate măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. B, CpG ODN este mai eficient atunci când este aplicat înainte de inocularea MVA sau împreună cu MVA, dar nu după administrarea MVA. Grupuri de șoareci BALB/c au fost imunizați cu MVA (105 PFU) și CpG ODN. În grupul 1, CpG ODN a fost injectat IN 1 zi înainte de administrarea MVA; în grupul 2, CpG ODN a fost administrat IN împreună cu MVA; în grupa 3, CpG ODN a fost IN injectat la o zi după imunizarea cu MVA; în grupa 4, șoarecii au fost imunizați IN cu MVA (10 7) singuri; iar în grupul 5, șoarecii au fost neimunizați. La trei săptămâni după imunizări, animalele au fost provocate cu IN cu virus 1 × 106 PFU WR. Greutatea individuală a șoarecului măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.