HBXIP și LSD1 Schelate de lncRNA Hotair mediată activarea transcripțională prin cancerul c-Myc

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Pentru corespondență: yelihong @ nankai.edu.cnzhangxd @ nankai.edu.cn

Abstract

Introducere

Celulele canceroase se caracterizează prin dobândirea mai multor caracteristici care le permit să devină tumorigenice, în care proliferarea necontrolată este una dintre cele mai fundamentale caracteristici ale celulelor canceroase (1, 2). Activarea oncogenelor și efectele lor de cooperare joacă un rol crucial în procesul de tumorigeneză și proliferare celulară. Reprogramarea mediată de oncogen a expresiei genelor, care permite celulei să dobândească tulburări metabolice, ciclul celular și alte aspecte, este un semn distinctiv al celulelor canceroase (1, 3, 4). Foarte important, proto-oncogena c-Myc, care a fost implicată în patogeneza majorității tipurilor de tumori umane (1, 5), afectează mai multe procese biologice celulare, inclusiv ciclul celular, sinteza proteinelor, aderența celulară, citoscheletul, metabolismul și reglarea miARN (6-8). Proteina c-Myc se leagă de o secvență de ADN numită cutie E (CACGTG) și se dimerizează cu Max pentru a media, abordând un total de 3.000 până la 4.000 de gene umane (9, 10). Proteina c-Myc conține un domeniu de legare de ADN de bază și un motiv de dimerizare cu fermoar helix-loop-helix-leucina (HLH-Zip), prin care ceilalți factori de transcripție și coactivatori pot afecta expresia genelor țintă c-Myc (11, 12). Cu toate acestea, mecanismul de bază al reglării transcripționale a genelor țintă c-Myc rămâne un mister nerezolvat.

Proteina cu interacțiune X a hepatitei B de mamifere (HBXIP), cunoscută și sub numele de LAMTOR5 (13), este o proteină de 18 kDa care conține un fermoar de leucină la C-terminal și secvența sa este bine conservată în rândul speciilor de mamifere (14). Am raportat că expresia HBXIP este în mod evident îmbogățită în țesuturile cancerului de sân. HBXIP acționează ca un coactivator transcripțional oncogen al mai multor factori de transcripție, cum ar fi TF-IID, STAT3, SP1, CREB și E2F1, în promovarea creșterii cancerului de sân și a metastazelor (15-20). Cu toate acestea, dacă HBXIP servește ca un coactivator al factorului transcripțional oncogen c-Myc în cancerul de sân rămâne puțin înțeles.

Având în vedere că activarea transcripțională este legată de mediul cromatinei, modificarea histonei H3 este modelul major al remodelării cromatinei (21). Demetilaza 1 lizin-specifică (LSD1), demetilarea medie a H3K4 duce la oxidarea ADN-ului local ca forță motrice în ansamblul complexului de inițiere a transcripției indus de c-Myc (22, 23). Epigenetica este implicată în transcripția mediată de c-Myc (24, 25). ARN-urile lungi necodificate (lncRNA) apar ca noi jucători în paradigma cancerului, demonstrând roluri potențiale atât în căile oncogene, cât și în căile supresoare tumorale. Aceste gene noi îndeplinesc funcții biologice remarcabile într-o varietate de tipuri de cancer uman (26). LncRNA HOX transcript antisens ARN intergenic (Hotair), identificat ca un 2,2 kilobază ncRNA care locuiește în locusul HOXC, se poate lega de LSD1. Hotair servește ca un schelă de complexe de modificare a histonelor cuprinzând LSD1 și complexul policomborepresiv 2 (PRC2), rezultând malignitatea tumorilor multiple (27, 28). S-a raportat că lncRNA PRNCR1 și PCGEM1 sunt implicate în complexul transcripțional androgen-receptor (29). Cu toate acestea, dacă Hotair este implicat în activarea transcripției indusă de c-Myc nu este bine documentat.

În acest studiu, încercăm să obținem informații despre mecanismul activării transcripției mediate de c-Myc. Interesant este faptul că datele noastre arată că HBXIP acționând ca un coactivator interacționează direct cu factorul de transcripție c-Myc. HBXIP și LSD1 formează un complex care este schelat de Hotair pentru a activa c-Myc în promotorul genelor țintă c-Myc, ducând la activarea transcripției genelor țintă c-Myc în celulele cancerului de sân. Astfel, descoperirea noastră oferă noi perspective asupra mecanismului prin care c-Myc funcționează în carcinogeneză.

Materiale și metode

Liniile celulare, transfecția și ARNsi

Linia celulară de sân imortalizată HBL-100 și linia celulară de cancer de sân MCF-7, T47D, LM-MCF-7 și SK-BR3 au fost cultivate în mediu RPMI 1640 (Invitrogen) cu 10% FCS. Celulele MDA-MB-463, MDA-MB-231 și HEK293T au fost cultivate în DMEM (Invitrogen) suplimentat cu 10% FCS. ARNsi care vizează ARNm HBXIP au fost raportate anterior (16, 19). ARNsi care vizează ARNm c-Myc, Hotair și ARNm LSD1 au fost enumerate în Tabelul suplimentar S1 (28). Celulele au fost transfectate cu plasmide sau siRNA corespunzătoare utilizând Lipofectamina 2000 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului.

Testele de imunoprecipitare a cromatinei și suprapunerea legării HBXIP și c-Myc

Testele de imunoprecipitare a cromatinei (ChIP) au fost efectuate folosind trusa EpiQuik de imunoprecipitare a cromatinei de la Epigentek Group Inc. Celulele MCF-7 au fost lizate la 24 de ore după transfecție. Complexele proteine / ADN au fost imunoprecipitate de anticorpi HBXIP sau LSD1, folosind IgG normal de iepure ca martor negativ. Primerii utilizați pentru amplificarea PCR au flancat cutia E în promotorii ciclinei A, eIF4E și LDHA (30-32). Selecția și legarea ChIP-ADN (ChIP-DSL) și analiza datelor genelor legate de HBXIP au fost efectuate de CapitalBio Corporation conform unui protocol de la Aviva Systems Biology. Experimentele au fost repetate de trei ori, iar rezultatele au fost analizate folosind MAS (http://bioinfo.capitalbio.com/mas/login.do) cu o valoare P de 1,0 × 106 pentru identificarea promotorului. Conform raportului anterior (33), seturile de date ale ChIP-seq pentru c-Myc au fost utilizate. Conform numărului de aderare și denumirii genei, au fost utilizate 1.348 de gene legate în top în seturile de date c-Myc pentru a fuziona cu genele legate de HBXIP pentru suprapunere. Căile genetice au fost analizate utilizând baza de date KEGG a DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/).