Frontiere Evaluarea efectelor geroprotectoare ale flavonoizilor selectați în Drosophila

Farmacologie integrativă și regenerativă

Editat de
Paul R. Ernsberger

Facultatea de Medicină, Case Western Reserve University, Statele Unite

Revizuite de
Medardo Hernández

Universitatea Complutense din Madrid, Spania

Hong Zhan

Morgridge Institute for Research, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

geroprotectoare

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Fizică Biologică și Medicală, Institutul de Fizică și Tehnologie din Moscova, Dolgoprudny, Rusia
  • 2 Institutul de Biologie, Centrul Științific Komi din Filiala Urală a RAS, Syktyvkar, Rusia
  • 3 Departamentul de ecologie, Universitatea de Stat Syktyvkar, Syktyvkar, Rusia
  • 4 Institutul Engelhardt de Biologie Moleculară, Academia Rusă de Științe, Moscova, Rusia
  • 5 Insilico Medicine, Inc., Universitatea Johns Hopkins, Baltimore, MD, Statele Unite

Introducere

Experimentele efectuate pe diferite organisme model au arătat că este posibilă modificarea farmacologică a activității căilor de semnalizare asociate longevității. Flavonoidele sunt un grup de compuși biologic activi naturali (Zern și Fernandez, 2005; Vauzour și colab., 2008; Kumar și Pandey, 2013; Brodowska, 2017). Efectele geroprotectoare ale diferitelor flavonoide asupra organismelor model au fost explorate în numeroase studii, dintre care majoritatea utilizează Caenorhabditis elegans ca organism model pentru a investiga efectele flavanolilor, flavonolilor și extractelor de plante (Pallauf și colab., 2017). Cu toate acestea, acest domeniu de cercetare nu a fost lipsit de certuri. Experimentele care implică utilizarea unui compus au produs rezultate inconsistente sau controversate atunci când au fost efectuate pe mai multe organisme model. De exemplu, s-a constatat că quercetina crește durata de viață a Saccharomyces cerevisiae (Belinha și colab., 2007) și C. elegans (Kampkotter și colab., 2008; Saul și colab., 2008; Pietsch și colab., 2009), dar nu au avut niciun efect asupra șoarecilor (Jones și Hughes, 1982; Spindler și colab., 2013). Aceste studii evidențiază importanța reproductibilității efectelor geroprotectoare ale unui compus între diferitele organisme model, în special având în vedere că căile de semnalizare asociate longevității sunt extrem de conservatoare din punct de vedere evolutiv (Moskalev și colab., 2016). De exemplu, durata de viață crescută a mai multor organisme a fost observată pentru medicamentul antiinflamator ibuprofen (He și colab., 2014) și imunosupresorul rapamicină (Harrison și colab., 2009; Bjedov și colab., 2010; Robida-Stubbs și colab. ., 2012).

Materiale și metode

C. elegans Analiza duratei de viață

C. elegans Analiza rezistenței la stres

Experimentele pentru evaluarea rezistenței la stres au fost efectuate în a 5-a zi de tratament cu flavonoizi. În experimentele privind stresul oxidativ, paraquat 100 mM (Methyl Viologen, Acros Organics) a fost adăugat la nematode. În experimentele de testare a șocului termic, viermii au fost încălziți la 33 ° C. Numărul de viermi morți a fost numărat după 24 de ore. Pentru fiecare tip de stres, experimentul a fost realizat în trei exemplare. Pentru fiecare grup experimental din fiecare experiment s-au utilizat 35-117 nematode, cantitatea totală din toate experimentele efectuate fiind de cel puțin 170 pentru fiecare variantă. Datele a trei experimente au fost combinate. Comparația statistică a procentului de animale moarte pentru datele combinate a fost făcută utilizând testul Fisher-test (Fisher, 1954).

D. melanogaster Analiza duratei de viață

Cantonul-S de tip sălbatic D. melanogaster (Bloomington Stock Center, Statele Unite) au fost separate prin sex și adăpostite în flacoane de 25 mm × 95 mm (30 de muște pe flacon) cu mediu de drojdie de zahăr din următoarea compoziție la 1 L: drojdie uscată - 8 g, agar - 7 g, zahăr - 30 g, gri - 30 g, acid propionic - 8 picături (Ashburner, 1989). Pentru fiecare grup experimental au fost utilizate 100-150 de muște. Muștele au fost menținute la 25 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Soluțiile stoc DMSO ale compușilor studiați au fost dizolvate în pasta de drojdie la concentrații finale sau 0,3, 0,5 și 1 μM. Aceste concentrații au fost alese deoarece sunt considerate fiziologice (Kanazawa, 2011). Acest amestec a fost aplicat pe suprafața mediului nutritiv începând cu prima zi de maturitate. Muștele erau transferate în sticle noi de două ori pe săptămână. Numărul muștelor moarte a fost numărat nu mai puțin de trei ori pe săptămână. Experimentul a fost reprodus de trei ori. Au fost efectuate aceleași analize statistice ca și pentru viermi.

D. melanogaster Analiza rezistenței la stres

Experimentele privind rezistența la stres au fost efectuate în a 10-a zi de tratament cu flavonoizi. Pentru fiecare grup experimental au fost utilizate 100-150 de muște. În experimentele de testare a stresului oxidativ, muștele au fost mutate în flacoane cu hârtie de filtru înmuiată într-o soluție de paraquat 20 mM (Metil Viologen, Sigma) în zaharoză 5% (0,2 ml per flacon) după 2 ore de foame. Muștele au murit de foame prin transfer în flacoane cu o hârtie de filtru saturată cu apă în locul mediului nutritiv. În experimentele privind stresul de șoc termic, flacoanele care conțin muștele și mediul nutritiv au fost încălzite la 35 ° C. Numărul muștelor moarte a fost numărat de două ori pe zi. Pentru fiecare tip de stres, experimentul a fost realizat în trei exemplare. Datele a trei experimente au fost combinate. Semnificația diferențelor dintre grupuri pentru datele combinate a fost evaluată cu testul Fisher-test (Fisher, 1954).

D. melanogaster Testul de fertilitate

Fecunditatea femelelor a fost evaluată o dată pe săptămână prin plasarea a trei femele și trei bărbați de aceeași vârstă în flacoane cu nutrienți proaspeți colorați cu cărbune activ și permițând 24 de ore pentru depunerea ouălor. După trecerea a 24 de ore, s-a numărat numărul de ouă pe femelă. Pentru fiecare variantă experimentală, au fost utilizate 50 de femele fertile. Bărbații au fost înlocuiți cu muște tinere o dată pe lună. Semnificația statistică dintre curbele cumulative a fost evaluată cu testul χ 2 utilizând programul Statistica 6.1 (StatSoft, Statele Unite) (Fisher, 1954).

D. melanogaster Testarea activității spontane

Pentru fiecare variantă experimentală, au fost selectate 30 de muște (10 muște pe flacon). Bărbații și femelele au fost analizate separat. Muștele au fost păstrate în condiții standard și transferate pe noi suporturi de două ori pe săptămână. Activitatea spontană a fost testată timp de 24 de ore în fiecare săptămână cu complexul hardware-software „Drosophila Population Monitor” (TriKinetics, Inc., Statele Unite). Analizele statistice au fost efectuate cu testul χ 2 utilizând programul Statistica 6.1 (StatSoft, Statele Unite) (Fisher, 1954).

RT-PCR

În acest test, au fost studiate numai concentrații de 0,3 și 1,0 μM ale compușilor selectați. În a 10-a zi de consum de flavonoizi, muștele au fost omogenizate. ARN-ul a fost extras folosind reactivul de liză QIAzol (Qiagen, Olanda) cu precipitații ulterioare de izopropanol. ARN-ul a fost purificat cu DNase I, kitul Amplification Grade (Life Technologies, Breda, Olanda) în conformitate cu protocolul producătorului. Sinteza ADNc a fost efectuată utilizând transcriptaza inversă Revert Aid, așa cum a recomandat Fermentas. PCR în timp real a fost efectuat pe sistemul PCR în timp real 7500 (Applied Biosystems, Statele Unite) utilizând următoarea procedură: (1) denaturare timp de 10 minute la 95 ° C, (2) denaturare timp de 15 s la 95 ° C, (3) recoacere timp de 30 s la 60 ° C, (4) alungire timp de 30 s la 60 ° C. Etapele 2-4 au fost repetate de 50 de ori.