Frontiere BAG5 promovează formarea de oligomer alfa-sinucleinic și interacționează funcțional cu

Medicină moleculară

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Mecanisme intracelulare ale procesării α-sinucleinei Vizualizați toate cele 11 articole

Editat de

Câștigător Beate

Universitatea din Erlangen Nürnberg, Germania

Revizuite de

Arun Upadhyay

Școala de medicină Feinberg, Universitatea Northwestern, Statele Unite

Christian Behl

Universitatea Johannes Gutenberg din Mainz, Germania

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

Descărcați articolul
- Descărcați PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Suplimentar
  Material
Citarea exportului
- Notă finală
- Manager de referință
- Fișier TEXT simplu
- BibTex

DISTRIBUIE PE

Scurt raport de cercetare ARTICOL

1 Departamentul de Medicină de Laborator și Patobiologie, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada
2 Divizia de Genetică și Dezvoltare, Krembil Research Institute, Toronto, ON, Canada
3 Divizia de Neurologie, Departamentul de Medicină, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada
4 Divizia de Neurochirurgie, Departamentul de Chirurgie, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada

Chaperonele moleculare sunt esențiale pentru menținerea proteostazei intracelulare și s-a demonstrat că au un rol protector împotriva toxicității mediată de alfa-sinucleină. Proteinele co-chaperone reglează activitatea chaperonelor moleculare și conectează rețeaua chaperonei la căile de degradare a proteinelor și de moarte celulară. Atanogenul 5 asociat Bcl-2 (BAG5) este o co-chaperonă care modulează proteostaza prin inhibarea activității proteinei de șoc termic 70 (Hsp70) și a mai multor ligase de ubiquitină E3, rezultând o neurodegenerare îmbunătățită în modelele bolii Parkinson (PD). Aici identificăm o interacțiune nouă între BAG5 și p62/sequestozom-1 (SQSTM1), sugerând că BAG5 poate lega rețeaua chaperonei de degradarea proteinei mediată de autofagie. Am constatat că BAG5 a îmbunătățit formarea oligomerilor alfa-sinucleinici patogeni și a reglementat nivelurile și distribuția subcelulară a p62. Aceste rezultate extind rolul BAG5 în procesarea alfa-sinucleinei și proteostaza intracelulară.

Introducere

Boala Parkinson (PD) este o boală neurodegenerativă incurabilă care afectează 1-2% din populația cu vârsta peste 60 de ani (Kalia și Lang, 2015). PD se caracterizează printr-o pierdere semnificativă a neuronilor dopaminergici în substanța nigra pars compacta, precum și prin prezența corpurilor Lewy (LB), incluziuni intracelulare cuprinse în mare parte din alfa-sinucleină agregată (Kalia și colab., 2013). În timp ce mecanismele exacte sunt încă necunoscute, se crede cu tărie că speciile oligomerice de alfa-sinucleină contribuie la moartea celulară observată în PD și alte boli asociate cu LB, inclusiv demență cu LB, atrofie a sistemului multiplu și boala Alzheimer (Kim și colab., 2014).

Diversi factori modulează procesarea și agregarea alfa-sinucleinei, inclusiv chaperonele moleculare. Chaperonele servesc la împăturirea proteinelor născute, a replierii proteinelor nepliate sau a proteinelor direcționate nepliate pentru degradare fie prin sistemul ubiquitin-proteazom (UPS), fie prin calea lizozomului autofagic (ALP) (Friesen și colab., 2017). Proteina de șoc termic 70 (Hsp70) este o chaperonă care s-a dovedit a fi implicată în procesarea alfa-sinucleinei și se leagă preferențial de fibrilele alfa-sinucleinei (Aprile și colab., 2017). Hsp70 poate reduce nivelurile de alfa-sinucleină greșite și agregate și poate proteja împotriva toxicității mediate de alfa-sinucleină (Auluck și colab., 2002; Klucken și colab., 2004; Dedmon și colab., 2005; Flower și colab., 2005; Huang și colab., 2006).

BAG5 este unic printre co-chaperonii BAG prin faptul că conține cinci domenii BAG, mai degrabă decât unul. BAG5 interacționează cu Hsp70 și îi inhibă activitatea de pliere (Kalia și colab., 2004). BAG5 interacționează și inhibă activitățile ligazei ubiquitinei E3 ale parkinului și proteinei C-terminale Hsp70 care interacționează (CHIP) (Kalia și colab., 2004, 2011). Inhibarea Hsp70, parkin și CHIP de către BAG5 perturbă proteostaza, mitofagia (De Snoo și colab., 2019) și promovează formarea oligomerilor alfa-sinucleinici, precum și a altor agregate proteice, care contribuie la moartea neuronală (Kalia et. al., 2013). În concordanță cu aceste constatări, s-a constatat că BAG5 promovează moartea neuronului dopaminergic în substanța neagră la modelele de rozătoare ale PD (Kalia și colab., 2004) și interacționează cu alte proteine relevante pentru PD, inclusiv LRRK2, PINK1 și DJ-1 (Beilina și colab. ., 2014; Wang și colab., 2014; Qin și colab., 2017; Tan și colab., 2019; De Snoo și colab., 2019).

Având în vedere că BAG5 reglează negativ mecanismele multiple de protecție a celulelor care implică prelucrarea intracelulară a alfa-sinucleinei, am dorit să investigăm în continuare căile moleculare în care poate funcționa BAG5 pentru a avansa înțelegerea BAG5 ca potențial modulator al sinucleinopatiilor. Prin urmare, am folosit un ecran de spectroscopie de masă pentru a găsi potențiale proteine BAG5 care interacționează. Aici identificăm și validăm o interacțiune funcțională între BAG5 și p62, o proteină cu funcții importante în ALP (Gamerdinger și colab., 2009) prezentată anterior pentru a proteja împotriva patologiei alfa-sinucleinei (Tanji și colab., 2015). Ulterior, evaluăm efectele BAG5 și p62 asupra nivelurilor oligomerilor de alfa-sinucleină și constatăm că BAG5 poate îmbunătăți formarea oligomerilor, precum și regla nivelul p62 și distribuția subcelulară.

Materiale și metode

Cultură de celule

Celulele H4 și HEK293 au fost cultivate în mediul Eagle modificat al lui Dulbecco (DMEM, Gibco) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Gibco), 1% antibiotic/antimicotic (Gibco) și incubate la 37 ° C cu 5% CO2. Celulele H4 au fost cultivate exclusiv pe plăci de celule + (Sarstedt, Inc.).

Generarea de linii de celule stabile

Celulele neurogliomului H4 de tip sălbatic au fost transfectate stabil cu plasmide GFP, GFP-BAG5 sau GFP-BAG5DARA utilizând Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific) conform protocolului producătorului. Plasmidele GFP-BAG5 și GFP-BAG5DARA au fost inițial dezvoltate de Kalia și colab. (2004) prin inserarea BAG5 și BAG5DARA în plasmida pEGFP-C1 (Clontech, U55763), care conține o etichetă GFP N-terminală și o genă de rezistență eucariotă G418. La 24 ore după transfecție, celulele au fost incubate în medii de selecție conținând 700 μg/ml G418 timp de 14 zile. Coloniile celulare care au atins o dimensiune de 100-200 celule au fost evaluate pentru încorporarea GFP-transgenă folosind microscopia fluorescentă. Acele colonii care exprimă în mod stabil transgenul au fost transferate pe plăci cu 96 de godeuri și propagate pentru caracterizarea ulterioară a expresiei transgenice.