Expunerea la bisfenol A în timpul sarcinii timpurii afectează remodelarea arterei spirale uterine și provoacă
Subiecte
Abstract
Introducere
Organismele vii sunt expuse zilnic substanțelor chimice care afectează endocrin (EDC) care sunt substanțe exogene, în mare parte produse de om, care prezintă activitate hormonală. Prin urmare, sunt capabili să interfereze, mai ales într-un mod negativ, cu căile endocrine normale și sunt astfel numiți estrogeni de mediu sau xenoestrogeni. EDC în special interferează cu procesele reglementate de estrogeni endogeni; EDC pot afecta negativ procesele de reproducere mediate de estrogeni 1 .
Materiale și metode
Animale
Șoarecii C57BL/6 și BALB/c de sex feminin au fost cumpărați de la Janvier Labs (Franța) și au ajuns la unitatea noastră de animale la vârsta de 8 până la 11 săptămâni. Femelele au fost ținute în grupuri de 2-4 animale pe cușcă. Șoarecii au primit apă și mâncare ad libitum și au fost adăpostite cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (7 am - 7 pm) la 22 ± 2 ° C și o umiditate a aerului de 40-60%. Experimentele au început după 2 săptămâni de aclimatizare.
Proiectare experimentală și colectare de probe
Experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale la aprobarea ministerială (Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD, Magdeburg, Germania). Experimentele au fost efectuate de persoane autorizate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor în cercetarea și predarea în agricultură. Șoarecii C57BL/6 femele au fost împerecheați cu masculi BALB/c pentru a avea o împerechere alogenă care reflectă situația mamiferelor din natură, inclusiv ființele umane. Ziua de înfundare a fost definită ca ziua de gestație (gd) 0. Din gd1, femeilor li s-au administrat zilnic 50 ug/kg BPA/zi diluate în etanol 0,1% timp de 7 zile prin gavaj oral. Șoarecii martori au primit etanol 0,1% folosind aceeași procedură. Numărul și dimensiunea implantării au fost urmărite pe tot parcursul sarcinii cu ultrasunete de înaltă frecvență. Femelele însărcinate au fost sacrificate pe gd5, gd10 sau gd14. Numărul de implanturi a fost înregistrat pentru animalele sacrificate pe gd5. Pentru acele animale sacrificate pe gd10 și gd14, s-au înregistrat implantarea și avorturile, precum și greutatea făturilor și placentelor. Uterele gravide au fost disecate și o singură implantare de la fiecare femelă la gd10 a fost disecată și fixată într-o soluție de 4% paraformaldehidă (PFA) conținând zaharoză.
Examinarea cu ultrasunete de înaltă frecvență
Pentru a analiza dezvoltarea embrionară și fetală intrauterină, s-au efectuat examinări cu ultrasunete la gd5, 8, 10, 12 și 14 folosind un sistem Vevo 2100 (Fiji Fil Visualsonics Inc). Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran într-o cutie etanșă. După ce au intrat în pierderea cunoștinței, șoarecii au fost fixați în poziție dorsală. Am folosit o cremă depilatoare pentru îndepărtarea blănii ventrale. În funcție de gd, dimensiunea implantării (gd5, 8, 10, 12), zona placentară, -grosimea și -diametrul (gd10, 14) sau fluxul de sânge în artera uterină (artera uterină) (UA, gd5, 8, 10, 12, 14) au fost înregistrate. Viteza sistolică de vârf (PSV) și viteza diastolică finală (EDV) au fost definite. În plus, s-au măsurat indicele de rezistență (RI) și indicele de pulsatilitate (PI). Analiza parametrilor înregistrați a fost făcută cu ajutorul software-ului Vevo 2100.
Măsurarea greutății fetale și placentare
Pentru documentarea greutății placentare și fetale la gd14, uterul bicornial al fiecărui șoarece a fost colectat și deschis pe lungime. Fetusii și placentele au fost separate de țesutul decidual înconjurător și de sacul galbenus. Apoi, greutatea fiecărui făt și a fiecărei placente corespunzătoare ar putea fi determinată folosind o cântare (Kern & Sohn GmbH, minim: 0,02 g, sensibilitate: 0,001 g). Restricția de creștere fetală a fost definită ca greutatea sub percentila a 10-a în comparație cu greutățile înregistrate pentru animalele din grupul martor 38 .
Histologie
Implanturile au fost fixate în PFA 4% conținând zaharoză 0,1 M (pH 7,4) timp de 6 ore prin agitare ușoară la temperatura camerei (RT). Înainte de depozitare peste noapte la 4 ° C, acestea au fost transferate în etanol 70%. A doua zi, specimenul de implantare a fost deshidratat prin serii ascendente de etanol și incubat în xilen înainte de încorporarea parafinei. Au fost tăiate 5 lamele subțiri pentru colorarea ulterioară a hematoxilinei și a eozinei (H/E; pentru analiza arterei spirale), colorarea imunofluorescentă pentru actina musculaturii netede (SMA; pentru analiza arterelor spirale) sau colorarea lectinei Dolichus Biflorus Agglutinin (DBA) pentru detectarea uterului Analiza celulei ucigașe naturale (uNK)). Pentru a analiza prezența uMC-urilor, s-a efectuat colorarea cu albastru de toluidină după cum urmează: uterele gestante la gd5 au fost incubate în etanol 96%. Pentru deshidratare, probele au fost păstrate în etanol 100% timp de două ore, înainte de a fi transferate în xilen pentru încă 2 ore și încorporarea ulterioară a parafinei. H/E, IF, lectină DBA și colorare cu albastru de toluidină s-au făcut așa cum s-a descris anterior 39 .
Analiza arterelor spirale uterine (USAs)
Parametrii care definesc remodelarea uSA au fost analizați în lamele colorate cu H/E ale implanturilor încorporate în parafină obținute la gd10. Pentru mai multe detalii despre cum au fost obținute probe pentru localizarea SA, vă rugăm să consultați 40. Prin utilizarea microscopului cu lumină Zeiss, au fost identificate și analizate 3-8 uSAs în decidua basalis a unei implantări pe șoarece. Prin utilizarea funcției de meniu „Contur (spline)” din AxioVision Rel. Programul 4.8, circumferința exterioară și lumenul a 3-8 artere per animal au fost măsurate în mărire de 20 ×. Valorile obținute au fost utilizate pentru calcularea diametrului (diametru = circumferință/π), a raportului perete-lumen (diametru uSA/diametru lumen), precum și grosimea peretelui (diametru uSA - diametru lumen)/2) . Valorile medii ale parametrilor menționați mai sus au fost calculate pentru fiecare animal.
Cuantificarea uMCs și uNKs
CMU au fost cuantificate la gd5 în secțiuni uterine colorate cu albastru de toluidină, în timp ce uNK-urile au fost cuantificate în probe de implantare colorate cu DBA-lectină utilizând un ocular micrometru care a fost introdus într-un microscop cu lumină. Ocularul micrometru a fost poziționat în zece puncte diferite în cadrul probei colorate. Cele 10 × 10 pătrate simple reprezintă 60 × 60 µm la o mărire de 20 ×, astfel ar putea fi examinată o suprafață de 0,36 mm². După calcularea mediei a 10 pătrate individuale și luând în considerare aria măsurată, s-a determinat cantitatea de uMC/uNK pe 1 mm². Lectina DBA și colorarea cu albastru de toluidină au fost efectuate așa cum s-a descris înainte de 39 .
Statistici
Distribuția seturilor de date (normale sau nu normale) a fost evaluată cu testul D’Agostino Pearson-Omnibus înainte de a analiza datele fie cu teste parametrice, fie non-parametrice. În funcție de distribuția lor, datele sunt prezentate ca mijloace ± S.E.M sau mediane. Numărul de șoareci, probe sau experimente efectuate, precum și testul statistic utilizat și conform valorile sunt indicate în legendele figurii corespunzătoare. GraphPad Prism 5.0 a fost utilizat pentru efectuarea analizelor statistice. Înainte de a analiza datele, am consultat Departamentul de Statistică al Facultății noastre (Institut für Biometrie und Informatik, Medizinische Fakultät, OVGU, Magdeburg) cu privire la testul adecvat pentru fiecare experiment.